外泌体：藏在体液里的 “细胞密语”，这篇终于讲透了！
外泌体（Exosome）是一类直径40-100 nm的盘状膜性囊泡，具有独特的生物学起源与功能特性。其发现可追溯至1983 年，Harding 团队与 Pan 团队分别在大鼠和绵羊网织红细胞中首次观察到这类囊泡，最初被认为是细胞代谢废物的排出载体。直至1987 年，Johnstone 团队正式将其命名为 “Exosome”（源于希腊语 “exo” 表示 “向外”，“soma” 意为 “体”），标志着细胞间囊泡通信研究的开端。
外泌体中包含多种物质如蛋白质、mRNA和microRNA,不仅能够用于疾病诊断以及病情监测，还能够用于细胞治疗、药物传递、医疗美容等领域，使得外泌体研究热度始终居高不下，有关外泌体研究的文章也成为Science、Nature等顶级期刊常客。
外泌体形成过程
研究表明，几乎所有类型的细胞均可分泌外泌体，包括免疫细胞、上皮细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞及癌细胞等。其生物发生过程遵循严格的细胞内膜 trafficking 路径，具体分为以下阶段：
1. 早期内体的形成与物质募集
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起始步骤
：细胞膜通过内吞作用（如网格蛋白介导的内吞）发生局部内陷，形成早期分选内体（Early Sorting Endosome, ESE），其腔内环境呈弱酸性（pH 6.5-6.8）。 -
物质装载
：ESE 作为初始分选平台，选择性募集跨膜蛋白（如四次跨膜蛋白 CD63、CD81）、胞质蛋白（如 TSG101、Alix 等外泌体标志物），以及来源于细胞微环境或胞质的核酸（mRNA/miRNA）和代谢物。
2. 晚期内体与多泡体的成熟
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腔内囊泡（ILV）的生成
：ESE 膜通过内芽生（Intraluminal Budding）方式向内凹陷，将富集的生物分子包裹形成腔内囊泡（Intraluminal Vesicles, ILVs），此时 ESE 转化为晚期分选内体（Late Sorting Endosome, LSE）。 -
关键机制
：该过程依赖内体分选转运复合体（ESCRT）或非 ESCRT 依赖途径（如神经酰胺介导的膜出芽），确保货物分子的精准包装。
3. 外泌体的释放与降解
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分泌途径
：LSE 进一步成熟为多泡体（Multivesicular Bodies, MVBs），部分 MVBs 与质膜融合，将 ILVs 释放至细胞外，即形成外泌体（直径 40-100 nm）。 -
降解途径
：另一部分 MVBs 与自噬体或溶酶体融合，通过溶酶体酶解作用降解内部成分，实现细胞内物质循环。
关键术语修正与补充
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“Lately sorting endosome” 修正为 “Late Sorting Endosome（LSE）”
，符合国际通用命名规范； -
“Multvesicular bodys” 修正为 “Multivesicular Bodies（MVBs）”
，统一复数形式； -
补充机制细节
：如 ESCRT 系统的作用、神经酰胺通路等，增强科学性； -
明确尺寸关联
：强调最终释放的外泌体直径与 ILVs 一致（40-100 nm），区分于其他细胞外囊泡（如微囊泡）。
外泌体蛋白类型
✅整体外泌体膜蛋白
主要包括四次跨膜蛋白（CD81、CD82、CD37、CD63）及其伴侣蛋白（MHC II、IGSF8、ICAM-1、SDC1-4、Intergrins等）、膜信号蛋白（EGFR、c-Kit、GRCRs、Notch receptors、T cell receptors、cytokine receptors等）；
✅脂质锚定外膜蛋白
包括C端糖基磷脂酰基醇（GPI）锚定蛋白（CD39、CD73、Juno、CD55、CD59、glypican-1、PrPSC）以及Hedgehog形态发生素等；
✅脂质锚定内膜蛋白
包括酰化微小GTP酶（Rabs、Ras、Rho等）、肉豆蔻酰化信号激酶（Src）以及棕榈酰化膜蛋白等；
✅外周表面蛋白
包括Wnt蛋白及其受体或伴侣蛋白、GPR177、BMPs、TGFβTNF、TNF相关凋亡配体、FAS配体、细胞因子以及ECM蛋白（Fibronectin、Tenascin C、ECM1等）；
✅内外周膜蛋白
包括细胞骨架连接蛋白（ERMs）及其配体蛋白（EBP50、CD44、CD43、IGSF8、PTGFRN等）、Alix及其配体蛋白（TGS101、ESCRTs0-4）、分子伴侣HSPs蛋白（HSP70、Hsp40/DnaJ、Hsp90、Hsp20、Hsp27、α/β-crystallins）；
✅外泌体酶
包括CD39、CD73、磷酸酶、焦磷酸酶、钙结合连接蛋白、磷酸盐转运蛋白、RNA编辑酶、脂肪酶、蛋白酶、糖基转移酶、糖苷酶以及代谢酶等；
✅可溶性蛋白和内含物
CD81、CD9、CD63以及其他具有异质性的蛋白；
外泌体提取方法
目前有多种外泌体提取方法，包括差速离心法、密度梯度离心法、试剂盒提取法、尺寸排阻色谱法、超滤法、聚合物沉淀法、免疫亲和分离法和压力筛分法等，其中差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。
外泌体鉴定方式
✅形态表征
使用透射电子显微镜（TEM）（常用方法）、扫描电子显微镜（SEM）、冷冻电子显微镜（Cryo EM）或者原子力显微镜（AFM）等观察外泌体形态；
Tips：（1）一般至少使用两种方法进行形态鉴定；（2）外泌体呈现圆形且直径为40-150 nm。
✅粒径分布特征
使用动态光散射技术（DLS）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）（常用方法）以及可调电阻脉冲传感（TRPS）等分析外泌体直径大小；
✅蛋白标志物分析
根据国际细胞外囊泡研究协会（ISEV）建议，至少检测三类蛋白（两阳一阴）进行外泌体分析，具体包括：
（1）跨膜或GPI锚定蛋白（阳性）：CD63、CD9、CD81等；
（2）外泌体内部蛋白（阳性）：TSG101、HSP70以及Alix等；
（3）其他细胞器或细胞结构蛋白（阴性）：Histone、LaminA以及Calnexin等；
Tips：CD63、CD9、CD81、TSG101、HSP70以及Alix是最常用的外泌体标志物；关于其他细胞器或细胞结构标志物可参考公众号文章《最全的细胞器标志物及亚细胞结构标志物！！！》；
外泌体保存方式
根据Cheng等人研究，外泌体保存液pH为pH 7.0，保存在-80℃条件下能最大程度保持外泌体活性和完整性，此外，尽量避免反复冻融也能维持外泌体活性和完整性。
