文献解读：综述外泌体生成、分泌与内化-2024-Trends in Cell Bio
外泌体分泌、摄取和cargo释放
题目：The ins-and-outs of exosome biogenesis, secretion, and internalization
通讯作者：Carole A. Parent；单位：密歇根大学生命科学学院
文献来源：Trends in Cell Biology；2024；原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0962892423001290#/
文章内容
为了提供信号特异性和靶向递送，细胞将特异性蛋白质、脂质、RNA和DNA包装在称为外泌体的40-180nm膜结合囊泡中。外泌体是小细胞外囊泡 （sEV） 的一个亚类，还包括微囊泡 （50-1000 nm） 和小外泌体 （30-150 nm），它们由 PM 向外出芽产生。
MVB与PM的融合导致腔内囊泡（ILV）作为外泌体释放。MVB的细胞类型和细胞内起源会影响外泌体内部及其表面存在的货物类型。
一、分泌过程
1.经典MVB分泌
1.1起始阶段：该过程始于细胞质膜（PM），通过内吞作用和初始的膜凹陷形成早期内体结构。这个阶段的内吞过程中，参与膜变形和内吞启动的多聚体蛋白质如caveolae和网格蛋白（clathrin）发挥关键作用，同时细胞膜上不均匀分布的脂质如神经酰胺和胆固醇也有助于内吞泡的形成。
1.2ILV生成：在早期内体成熟为晚期内体的过程中，内体膜限制层会出现由ESCRT（内体分选复合体）通过螺旋状装配介导的内陷和切割现象，形成ILVs（内体腔内小囊泡）。ESCRT系统分为四个主要复合体（ESCRT-0、I、II和III），依次参与ILV的形成，确保膜包裹的货物得以精确分选和囊泡化。
1.3MVB成熟：晚期内体进一步转变为CD63阳性的MVB，其中含有多种ILVs亚群，这些ILVs根据其成分和命运的不同，可以被划分为单独的ILVs或者成簇的连接ILVs。
1.4ILV分选与装载：在MVB成熟期间，通过内质网（ER）与MVB膜接触位点（MCSs）发生的交互作用，使得cargo能够装载到ILVs中。此时，膜上的微域（microdomains）如富含神经酰胺和胆固醇的区域对于物质选择性装载至关重要。
1.5分泌阶段：最终，成熟的MVB与质膜融合，释放其内部的ILVs作为富含CD63的外泌体进入细胞外环境。这个过程受到多种因素调控，包括膜脂质浓度、MVB的酸化状态以及诸如IFITM3等蛋白的影响。
2.非经典MVB分泌
2.1.回收内体
在多种癌细胞中， mTORC1信号传导的抑制可以充当“外泌体开关”。这导致晚期内体衍生的富含 CD63 的外泌体的消失，以及缺乏典型外泌体显着标记物的 Rab11 阳性外泌体的生物发生。
2.2.分泌性自噬
是一种细胞自噬的非传统形式，它不直接导致细胞内物质向溶酶体降解，而是促进胞内物质通过自噬体与质膜而非溶酶体融合的方式，将其内容物以胞外囊泡的形式非经典地分泌到细胞外环境中。
2.3.自溶酶体
早期凋亡细胞以 caspase 3 依赖性方式分泌凋亡外泌体样囊泡 (AEV)。它们的大小与经典外泌体相似，但相对更致密。与凋亡小体的抗炎功能相反，它们在凋亡过程中启动炎症反应。
2.4.线粒体
在稳态过程中，双膜线粒体衍生囊泡 (MDV) 与典型 MVB 融合，以含有线粒体 DNA (mtDNA) 的外泌体形式释放其内部囊泡，同时释放典型外泌体。
2.5.核膜
中性粒细胞将LTB4 及其合成酶包装在 MVB 中，MVB在中性粒细胞趋化过程中以外泌体形式释放 ILV，而这些MVB 的生物发生起源于核膜，那里存在 LTB4 合成机制。
二、外泌体分泌的调控机制
1ILV 生物合成的调控
1.1MVB内不同 ILV 池的动态
MVB 包含不同的聚集 ILV 池，其中 只有ILV 的一小部分作为外泌体释放，而另一个池包含运往溶酶体降解或货物转移到其他细胞器。这些 ILV 可以动态融合回 MVB 的限制膜，这个过程被称为 ILV 逆流。
这可以支持MVB的膜平衡，是维持MVB热力学稳定性所必需的。此外，ILV 逆流可在抗原加工过程中促进 ILV 货物（抗原）向细胞质的递送，并促进主要组织相容性复合物 II (MHC II)抗原呈递。
1.2胆固醇和神经酰胺决定 ILV 大小
ER-内体MCS不仅可以控制ILV中的货物分拣，还可以调节外泌体的含量和大小。在内体上，Cav1 以胆固醇依赖性方式调节 ILV 群体的分离以及 ILV 内的货物分类。
研究发现，Cav1缺陷的成纤维细胞会产生紧凑致密、富含胆固醇的外泌体。转移性癌细胞分泌的外泌体中ALIX和Cav1水平升高与外泌体胆固醇水平升高以及外泌体大小从平均100nm减小至~50nm相关。
2外泌体分泌过程的调控
外泌体的释放需要两个步骤：MVB 与 PM 对接；MVB 限制膜与 PM 融合。钙离子对于大多数情况下的外泌体分泌是必需的，小GTPase（用于对接）和 SNARE（用于膜融合）参与调节MVB 与 PM 的融合。此外，外泌体的分泌还受到许多因素的调节：
2.1细胞骨架重塑
肌动蛋白结合蛋白 cortactin 可以控制向皮质肌动蛋白移动的 MVB 数量，并通过稳定分支肌动蛋白结构来增加 PM 对接位点的数量。稳定的分支肌动蛋白网络最终在非常规肌球蛋白的帮助下促进微管相关的 MVB 转移到皮质肌动蛋白。
2.2回收内体机制
回收内体机制在从降解型MVB转变为分泌型MVB中发挥着至关重要的作用。Rab11 是一种存在于核周回收内体上的小 GTP 酶，它通过调节 MVB 在PM 上的对接来促进钙依赖性 MVB-PM 融合，Rab11/Rab4的缺失会减少外泌体的分泌并导致货物积累。
2.3ER膜接触位点
细胞内胆固醇水平可以诱导晚期内体上氧甾醇结合蛋白 1L (ORP1L) 的构象变化，增强其与ER驻留适配器蛋白VAP的相互作用。
同时，ER-晚期内体MCS中ORP1L的存在还介导了Rab GTPase从Rab7a向Arl8b的转换。这种转换允许原本去往溶酶体进行降解的MVBs流向质膜，从而转变为具有分泌功能的MVBs。
2.4晚期内吞机制
Rab27a 和 Rab27b 各自调节 MVB 成熟和外泌体释放的不同阶段:
Rab27b 定位于核周区域并介导膜从 TGN 到MVB 的转移。它还通过调节 MVB 从微管到皮质肌动蛋白的转移，帮助将分泌型 MVB 保留在细胞外周；
Rab27a 定位于外周 CD63 阳性 MVB，防止 MVB 彼此或与其他囊泡融合，从而促进 MVB 与 PM 融合。
2.5溶酶体机制
肝细胞脂质超载期间的溶酶体膜通透性、TRPML1(Transient Receptor Potential Mucolipin 1)、神经酰胺结合蛋白 LAPTM4B、tetraspanin 6等均可对MVB与溶酶体的融合过程进行调控，从而间接控制外泌体的分泌。
总的来说，细胞已经进化出一种机制来调节外泌体的释放，以进行长距离通信（如趋化过程中的信号中继），或短距离信号传导（如免疫突触上的 MHC II 呈现）。
三、外泌体摄取和货物释放
1摄取：
1.1特异性：
基于肌动蛋白的细胞突起（丝状伪足）充当外泌体摄取的“内吞热点”。在这种现象中，外泌体在被内吞之前沿着丝状伪足和回缩纤维向细胞体移动，内化时间从立即到20分钟不等，具体取决于丝状足的长度。
外泌体外表面货物（exofacial cargo）除了与PM上的特异性受体结合来促进靶细胞中的信号转导反应，还在多种情况下为外泌体的内化过程提供了特异性。
1.2非特异性：
1.2.1微/大胞饮作用，通过该途径内化的外泌体货物通常因包裹外泌体的内体与溶酶体的融合而降解。
1.2.2脂筏介导的内吞作用和硫酸肝素蛋白聚糖（HSPG）介导的内化，虽然一般情况下这也被认为是非特异性的，但由于某些细胞上较高的HSPG和脂筏丰度促使外泌体更易被这些细胞摄取，因此也提供了一定程度的选择性。
1.3其他方式：
外泌体 α-突触核蛋白cargo释放到受体细胞中并不通过网格蛋白依赖性或胞饮作用。这表明这些外泌体不会内化，而是与PM融合，在细胞质中直接释放其内部货物。
2释放：外泌体货物内化后在细胞内被内体包裹，通常会被递送至受体细胞的特定区室，如线粒体、ER、PM或胞质溶胶，最近的一些研究揭露了几种利用的方式:
2.1内化的外泌体沿着内质网轨迹移动，类似于类似于ER-内体MCS，随后有选择的释放；
2.2外泌体的膜与内体膜融合，导致货物的释放；
2.3完整的外泌体从内体释放到细胞质中；
2.4完整的外泌体从受体细胞中重新分泌；
2.5包裹外泌体的内体与溶酶体融合，随后在溶酶体胞吐过程中释放。
文章总结
MVB 生物生成机制具有冗余性，这种冗余性对于在正常和病理条件下产生多样化、动态且具有选择性的外泌体至关重要。同时外泌体多样的摄取和吸收方式更有效保证了机体内信号交流的丰富及有序。但对于其中许多的调控机制仍知之甚少，有待进一步研究。
