外泌体治疗 | 外泌体在脑梗上的治疗潜力
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背景
缺血性脑卒中（脑梗）是一种急性脑血管疾病，是全球死亡和残疾的主要原因之一。在全球范围内，11%的死亡是由卒中引起的，使其成为第二大最常见的死亡原因。
由于人口老龄化，卒中患者的绝对数量持续上升。然而，最近高血压药物的进步导致发达国家卒中发病率的下降。大约87%的卒中被归类为急性缺血性卒中 (AIS)。目前的治疗严重依赖组织型纤溶酶原激活剂(tPA)溶解血栓，但tPA会破坏血脑屏障 (BBB) 的完整性，阻碍卒中恢复。
过去几十年来，预防和医疗保健的发展降低了缺血性卒中患者的死亡率。因此，缺血性脑卒中现在可以被视为一种慢性致残疾病，而不是一种致命疾病。
然而，许多幸存者有一系列后遗症，如运动、认知和精神障碍，严重影响患者生活质量。缺血性卒中的治疗方法包括溶栓治疗、手术干预和康复等，核心目标是恢复脑功能、减少神经损伤和防止复发。
狭窄的治疗时间窗、个体禁忌症、脑出血性转化等因素限制了缺血性卒中的临床治疗。此外，尽管95%已发表的临床前研究显示，1990-2018年，神经保护药物在动物缺血性卒中模型中呈阳性，但其中很少有药物在临床III期试验中取得令人满意的结果。
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缺血性脑卒中的病理生理学
急性缺血性卒中（AIS）是由血管堵塞引起的。血管阻塞后，激发缺血级联反应。葡萄糖和氧气的剥夺导致从有氧代谢到无氧代谢的转换，这导致乳酸的产生增加，从而损害健康的神经元。
同时无氧代谢不能产生足够的ATP来支持能量需求过程，如维持离子稳态。细胞变得去极化，并且不能将钙保持在细胞内基质之外，进一步去极化自身。
谷氨酸转运蛋白在去极化反应中改变方向，并将谷氨酸释放到细胞外空间。细胞外谷氨酸迁移到附近的NMDA受体，进一步传播兴奋毒性波和钙内流。钙激活线粒体诱导的细胞死亡，并对神经元组织造成全面损伤。这通过液化坏死的过程转化为坏死组织，受影响的区域被称为脑梗塞。
如下图所示，再灌注损伤随着血流的重新引入而发生。再灌注的特征是氧化应激和炎症增加。总的来说，坏死的神经元组织和再灌注损伤破坏了血脑屏障的完整性。
血脑屏障的渗漏会导致水肿，增加神经毒性物质的渗透性，导致AIS的进一步恶化。对血脑屏障的损害是AIS病理生理学的一个重要方面。
03
外泌体在缺血性脑卒中的治疗潜力
已经研究了间充质细胞 (MSCs) 在AIS后恢复BBB完整性的潜力。截至2023年7月，14项侧重于卒中后间充质干细胞临床应用的临床试验正在进行或已经完成。2024年8月，在www.clinicaltrials.gov，没有注册关于MSC外泌体用于中风治疗的临床试验。
鉴于间充质细胞可能无法超越受损的血脑屏障，它们对血脑屏障完整性的有益影响是通过外泌体介导的。MSC外泌体已经成为当前再生医学的组成部分。本篇文章介绍了MSC外泌体在介导神经保护和修复作用中的潜力，以及它们在增强血管生成和促进血脑屏障完整性恢复中的作用。
外泌体和外泌体miRNAs在缺血性卒中的治疗中发挥着潜在的作用，这可以通过调节炎症反应、促进神经修复、抑制细胞凋亡等途径发挥保护作用。研究表明，外泌体和外泌体miRNA可以通过抑制炎症反应、减少凋亡、改善氧化和抗氧化系统的失衡以及调节细胞自噬等过程来改善缺血性中风的预后。
一、外泌体和炎症反应
炎症是由感染性刺激或非感染性刺激 (如细胞损伤、物理损伤或毒素) 诱导的免疫反应。缺血后炎症与动物和人类的急性血脑屏障破坏、血管源性水肿、出血性转化和神经预后不良有关。
神经元中的NLRP3炎症小泡促进了大脑中动脉闭塞 (MCAO) 诱导的神经炎症，并且NLRP3的早期阻断减弱了炎症反应并稳定了BBB，从而减轻了脑缺血-再灌注损伤。
先前的研究发现，在缺血性卒中的动物模型中，外泌体分泌在NLRP3活化中具有双重作用。一方面，外泌体可以促进NLRP3的激活。小鼠外周血源性外泌体激活了/AKT/mTOR通路，降低了自噬，加重了神经炎症损伤。另一方面，外泌体抑制炎性囊泡激活。MSCs-exo可通过调节小胶质细胞极化来抑制NLRP3炎性泡介导的炎症和局灶性死亡，从而改善脑缺血再灌注损伤。进一步的研究表明，MSCs-exo可能通过miR-23a-3p发挥其治疗作用。
不同来源的外泌体参与了缺血性卒中后的炎症反应过程，调节不同来源外泌体的释放和外泌体miRNA表达可能是抑制卒中炎症反应的有效治疗手段。
二、外泌体和细胞凋亡
细胞凋亡是在某些生理或病理条件下发生的有组织的细胞死亡过程。研究表明，缺血和缺氧导致自由基过度产生、Ca2+超载和兴奋性毒性，从而启动凋亡过程并加剧脑血管损伤。不同来源的外泌体和外泌体miRNAs参与脑缺血-再灌注诱导的细胞凋亡的调节过程。研究表明，星形胶质细胞外泌体 (AS-exo)可以通过转移miR-190b抑制多糖剥夺诱导的自噬和神经元凋亡。内皮祖细胞外泌体 (EPC-exo)可以通过抑制凋亡和促进血管生成来减轻脑缺血-再灌注损伤。类似地，研究发现间充质干细胞外泌体通过抑制细胞凋亡和细胞毒性，显著增加了神经元的活力，并减轻了缺血-再灌注损伤。此外，神经干细胞外泌体 (NSCs-exo) 通过转移miR-150-3p和抑制脑损伤后的神经元凋亡而发挥神经保护作用。
调节不同来源的外泌体释放及其miRNA表达可能是抑制缺血性卒中后细胞凋亡的有效途径。
三、外泌体和氧化应激
氧化应激是引起脑循环内皮功能障碍的主因。有证据表明，缺血区域活性氧的快速增加破坏了抗氧化防御系统，损害了细胞大分子，导致局部的自噬、凋亡和坏死。此外，血流的快速恢复增加了组织的氧合水平，这导致活性氧的进一步增加，引起再灌注损伤。
临床研究表明，接受溶栓治疗的缺血性卒中患者血清中的氧化应激标志物升高。许多研究通过不同来源的外泌体和外泌体miRNAs调节氧化应激来治疗缺血性卒中。
研究发现，内皮祖细胞外泌体（EPC-Exo）携带的miR-210可以以时间依赖的方式释放并转移到神经元，减少活性氧的产生，提高神经元的生存能力。还发现神经祖细胞外泌体(NPC-exo) 通过miR-126减少活性氧产生，抑制神经元凋亡，发挥神经保护作用，与EPC-exo联合使用比单独使用更有效。此外，小胶质细胞外泌体通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻了氧-葡萄糖剥夺诱导的氧化损伤。
调节不同来源的外泌体释放和外泌体miRNA表达可以有效减轻氧糖剥夺后氧化应激诱导的神经元损伤。
四、外泌体和自噬
自噬通过降解和回收错误折叠的蛋白质和受损的细胞器，为合成必需蛋白质提供营养，从而帮助维持细胞能量和功能稳态。然而，过度的自噬会破坏必需的细胞成分，导致细胞死亡。
由于脑缺血导致的氧气和葡萄糖供应不足导致AMP/ATP比率升高，从而激活AMP依赖性蛋白激酶途径，通过直接或间接途径启动自噬过程。
自噬的持续激活可能对缺血性卒中的预后产生不利影响。MCAO大鼠的大脑毛细血管中观察到自噬活性增强和紧密连接蛋白降解，证明自噬在缺血诱导的BBB完整性丧失中起着重要作用。
虽然自噬在缺血性卒中发病机制中的确切作用尚不清楚，但现在已经认识到适度激活自噬具有神经保护作用，而过度激活自噬则是有害的。
目前，使用外泌体的治疗措施显示出解决自噬在卒中发病机制中的“双刃剑”作用的巨大潜力。一项研究发现，MSCs-exo可以通过ETV4/Sirt1轴促进自噬，以减轻早期脑缺血-再灌注损伤。相反，脂肪干细胞分泌的外泌体(ADMSC-exo) 通过miR-30d-5p抑制自噬介导的小胶质细胞极化来预防急性脑损伤。体外和体内研究的结果表明，星形胶质细胞外泌体（AS-exo）和神经元的共培养或通过尾静脉注射AS-exo可以抑制自噬来减轻缺血-缺氧诱导的神经元损伤。
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总结与展望
总的来说，MSC外泌体在再生医学领域展现出了光明的未来。所有类型的MSC外泌体都表现出不同程度的抗凋亡、血管生成和抗炎特性，但没有直接比较每种类型MSC外泌体的研究。
不幸的是，证明脐带间充质干细胞外泌体对恢复血脑屏障完整性有益的研究尚未发表。研究团体面临着破译MSC外泌体积极作用的分子机制的巨大任务。到目前为止，只有有限数量的研究集中在血脑屏障的完整性。
外泌体的蛋白质修饰可以增强向特定位点的递送。特别是，MSC外泌体有可能用于个性化医疗。已经多次表明，外泌体确实会在肝脏和肠道中聚集，但迄今为止，不清楚这是否会带来副作用。
在任何临床应用之前，迫切需要优化MSC外泌体的剂量，并找到一种安全有效的方法来冷冻储存外泌体。一些人喜欢将外泌体冷冻保存在-80°C的PBS中，而另一些人则选择将外泌体放在冰箱中。也进行了研究低温保存剂的实验，但是迄今为止，还没有研究其潜在的副作用。尽管如此，外泌体已经比细胞疗法具有更大的优势，因为外泌体不需要DMSO进行冷冻保存。
临床使用前的另一个巨大障碍是生产的规模化。即使现在外泌体分离纯化方法或产品非常完善，超速离心仍是分离外泌体的金标准。这是一个冗长且耗时的方案，受到超速离心管和体积的限制。新方法，如切向流或尺寸排阻色谱正在慢慢进入该领域，即使它们也有缺点。
