细胞外泌体的介绍
外泌体是活细胞释放的直径约30-120nm的圆形囊泡，它在人体细胞间通讯和组织交互中发挥着许多关键作用：比如用作疾病的早期诊断、治疗剂，以及预后生物标志物等。
在临床应用中，由于外泌体来源的样本类型、环境刺激和数量的不同，我们可以从包括体液、固体组织和细胞培养基在内的各种来源，通过不同的程序分离外泌体。因此本文全面介绍了现有的外泌体分离方法和表征策略，希望促进外泌体能大规模、快速、简便、高得率、高纯度、安全、低成本地应用到临床治疗中。
细胞外囊泡（EVs）通常分为三个不同的类别：外泌体（约30-120nm）、微囊泡（约100-1000nm）和凋亡小体（约500-3000nm）。这三种主要亚型通过其生物发生、释放途径、大小、形态、表面生物标志物、内容物和功能来区分。每个细胞都会产生并将其外泌体释放到生物体液中，包括血液、唾液、母乳、尿液、淋巴液、玻璃体液、胆汁和脑脊液。健康人血清中外泌体的浓度高达7×10^8个/毫升。
外泌体可以从宿主细胞转移到靶细胞，从而导致表观遗传信息的转移以及受体细胞的细胞活动重编程。外泌体可以运输各种货物分子，包括代谢物、DNA片段、mRNA、lncRNA和miRNA、蛋白质和脂质。外泌体能反应生理健康状态，还可以作为病理生理应激下细胞间通讯的介质：它们在许多促进癌症进展的过程中发挥着关键作用，包括维持癌症转移、治疗耐药性的出现、炎症反应和免疫调节等。
外泌体必须从微泡、凋亡小体和其他生物分子等非外泌体成分中分离出来，且要达到足够的量、纯度和大小，才能进行基础研究。理想的标准化外泌体研究分离方法应简便快捷，具有高通量、高纯度、高回收率和低成本的特点。因此我们对比总结了现有的超速离心（UC）、超滤（UF）、免疫亲和捕获（IA）、尺寸排阻色谱（SEC）、聚乙二醇（PEG）、基于微流控技术（MF）和基于微芯片（MC）的等外泌体分离方法。
超速离心法分为差速超速离心法和密度梯度超速离心法，是最常用的外泌体分离方法。传统的超速离心法基于沉淀原理，用于从复杂生物样本中分离外泌体。该方法也包括一系列低速离心以分离细胞、微泡和凋亡小体，然后再以100,000×g的高速下进行超速离心以沉淀外泌体。
超速离心法操作简便，长期来看成本效益高，且能处理大量样本。然而，超速离心过程中产生的高剪切力有可能破坏外泌体的结构。外泌体丢失、融合、变形以及蛋白质等污染物的共分离是该方法的主要缺点。
超滤（UF）：
超滤（UF），又称膜过滤。它的基本原理是利用膜滤器根据外泌体的大小和分子量将其从所有其他样本成分中分离出来。该方法首先使用孔径为0.1、0.22和0.45微米的膜过滤器将外泌体与包括细胞、碎片和微粒在内的较大污染物分离。然后再使用膜过滤器分离可溶性和聚集性蛋白质。如果需要进一步减少体积，样品可在100,000-200,000xg的离心力下离心以沉淀外泌体。
超滤过程中所施加的压力可能会因剪切力而造成外泌体损伤，因膜吸附而造成外泌体损失，以及因颗粒聚集而导致膜堵塞，这可能会降低外泌体的得率并增加处理时间。
尺寸排除色谱法（SEC）：
尺寸排阻色谱（SEC），也称为凝胶过滤，是最温和的色谱法，常用于根据大小分离和纯化包括外泌体在内的颗粒。操作方法是将样品置于顶部，并通过色谱柱的多孔固定相。混合物中具有较小流体动力学半径的成分能够更快地穿过这些材料，而半径较大的外泌体则被阻挡在孔隙之外，从而能对外泌体进行分离。尽管该过程完成得相当迅速，但在后续步骤中仍需进行超速离心以浓缩样本。这种能有效去除脂蛋白和血浆蛋白等杂质，但要获得纯的外泌体却颇具挑战性。
免疫磁珠是一种独特的工具，能够加以改造以识别外泌体膜表面的目标受体蛋白（如 CD9、CD56、CD63、CD81、CD82、CD91、CD105、CD147 和 CD151等），来分离和捕获不同细胞类型产生的不同外泌体亚群，研究外泌体亚型功能后果的变化。此外，该方法还能对单个外泌体进行成像，并识别其膜上的蛋白质标记。IAC 是一种温和的方法，在外泌体分离和纯化后能保持其功能。
BioLegend公司有基于磁珠分选的外泌体富集产品（MojoSort Microbead Human Exosome Selection Kit），有以下特点：
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无需超高速离心，或者利用外泌体预富集试剂盒对样本进行预富集。
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操作简单，手持式磁极即可1小时内快速分选。
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MojoSort磁珠分选试剂盒，可以和部分友商的柱式系统，以及手持式磁极兼容（如有需要请联系当地技术支持确认后使用）。
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分选完成后，磁珠（Beads）可以从外泌体上解离下来。分选后的外泌体可以支持后续下游实验，如功能实验，流式细胞术，WB, qPCR等。并且保持了良好的活性和功能。
MojoSort外泌体分选试剂盒功能性实验结果：
为了验证分选后外泌体的功能性，我们先用Cell Brite red将MCF-7细胞培养上清液染色，然后用MojoSort Microbead Human CD81 Exosome Selection Kit将上清液中的外泌体进行分选。接着将染色的外泌体与用DAPI染色后的MCF-7细胞共培养6小时后，用免疫荧光进行观察。结果显示带有标签的外泌体被细胞摄取（图7），表明释放的是具有生物学活性的外泌体。
通过免疫亲和力提取的外泌体的特异性显著高于超速离心法。然而免疫亲和力技术有两个主要限制：1.只能用于较小的样本量。2.这种方法只能分离具有阳性标志物的外泌体亚型，而不能分离所有类型的外泌体。
与前面所述的分离方法不同，沉淀法（图8）主要依靠使用高度亲水性聚合物来化学沉淀外泌体。目前最广泛用于外泌体分离的高度亲水性聚合物是聚乙二醇（PEG）。基于沉淀的分离方法简便、快速、成本低，所需样本量小，且无需专用设备，但缺点是产品纯度较低。此外，通过沉淀法分离的外泌体可能含有生物聚合物，这会增加后续分析的复杂性。
基于免疫亲和力的微流控外泌体分离技术在微流控装置的底部涂有针对CD9、CD63和CD81等常见表达的外泌体表面标志物的抗体，这些抗体可捕获外泌体，从而实现其分离、收集和分析。除了基于免疫亲和力的微流控外，外泌体还可以通过声学微流控方法根据其大小进行分离。基于微流控的外泌体分离方法也有一些缺点，包括需要专门的昂贵设备、采样效率低、通道经常堵塞等。
通过上述方法分离外泌体后,应该对外泌体的大小、形态、表面电荷、密度、生物标志物表达、得率和纯度进行表征。因此我们总结了包括流式细胞术（FC）、电阻脉冲传感（RPS）、动态光散射（DLS）、电子显微镜（SEM/TEM/Cryo-EM）、原子力显微镜（AFM）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）等常用的外泌体表征技术（图1）。
外泌体表征方法包括了外泌体的形态鉴定和生物标志物蛋白鉴定。常见的外泌体生物标志物蛋白包括多跨膜蛋白（如CD9, CD40, CD63, CD81, CD82, heterotrimeric G proteins GNA）、单跨膜蛋白（如Integrins, Major Histocompatibility Class I and II, heparan sulphate proteoglycans, and transferrin receptor）以及脂锚定蛋白（如CD73和CD59）。
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超微结构分析法
1.1透射电子显微镜（TEM）法
透射电子显微镜（TEM）是检测外泌体形态和结构最有效的工具之一，并且染色过程简单快捷，仅需几个小时，且TEM的分辨率约为1nm。使用常规TEM可以检测外泌体的大小、形态和结构，并检测其杂质。
1.2低温电子显微镜(Cryo-EM)
透射电子显微镜（TEM）的一种类型是冷冻电子显微镜（cryo-EM），它能让样品保持在天然的水环境中，无需对样品进行脱水或固定处理，样品可在液氮（低于-175°C）中保存，且可避免脱水造成的伪影。冷冻透射电子显微镜也已用于外泌体（EV）分析，它还适用于拍摄具有膜结构和腔隙的外泌体。
1.3扫描电子显微镜（SEM）
扫描电子显微镜（SEM）通过使用细小的点状电子束逐行扫描样本，因此SEM能够聚焦于材料表面，从而提供外泌体的三维图像。与在TEM下观察到的杯状形态不同，SEM显示外泌体呈球形且向外凸起，没有中央凹陷。
1.4原子力显微镜（AFM）
外泌体形貌研究可以使用AFM进行，其分辨率约为1nm。AFM基于光学和电子衍射原理识别探测尖端与目标外泌体表面之间的相互作用。
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纳米颗粒跟踪分析（NTA）
纳米颗粒跟踪分析（NTA）可用于估算外泌体浓度和单个颗粒的大小分布。在纳米颗粒跟踪分析系统中，30至1000nm的囊泡被流动驱使，NTA软件追踪单个颗粒的布朗运动，并确定其形态大小和总体浓度。该方法可以通过将激光光散射显微镜与摄像系统相结合，能够对溶液中包括外泌体在内的荧光纳米颗粒进行观察和记录。
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不对称流场流分级（AF4）
AF4可以根据密度和流体动力学特性分离外泌体。在众多研究中，AF4和NTA已被用于外泌体定量的比较。与NTA不同，AF4更擅长处理外泌体的大小异质性，可能被视为一种用于表征生物体液中外泌体亚群的前沿分析方法。
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电阻脉冲传感（RPS）
电阻脉冲传感（RPS）可以利用其在微小孔径中移动时的电阻变化，对囊泡进行尺寸测定。使用RPS可以检测直径在50至1000nm之间的囊泡。
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可调电阻脉冲传感（TRPS）
TRPS是一种新型的非光学技术，它已成功用于表征胶体颗粒以及悬浮液中各种纳米颗粒和生物分子，其尺寸范围从约50nm到细胞大小，这一特性对于研究细胞功能和细胞外囊泡的摄取至关重要。该方法在细胞外囊泡大小分布评估方面也得到了大量研究，并且甚至已被开发用于向治疗阿尔茨海默病和向肿瘤细胞递送抗肿瘤miRNA的生物分子。
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流式细胞术（FCM）
外泌体亚群可通过其表面的膜生物标志物，基于磁珠的流式细胞术半定量检测。该方法简而言之，将外泌体封闭后，依次加入一抗和荧光标记的二抗，并与阴性对照进行比较，以检测特定的膜生物标志物蛋白。流式细胞术通过检测包含外泌体在内的悬浮颗粒。流式细胞术不仅能检测样本中的颗粒，还能表征EV的结构和形态。
和其他方法相比，流式细胞术检测EV的方法可以制定标准化流程，能够检测大量样本中罕见的外泌体，并通过其表面抗原识别其细胞来源。因此现在已经上市了一些高端专用流式细胞仪，具有更高的灵敏度、前向散射检测（FSC）、荧光放大和高分辨率成像功能，能够对外泌体进行精确、直接且高通量的表型评估。
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基于荧光的分析（FBA）
基于荧光的分析系统可以有效分析外泌体。与落射荧光显微镜相比，对比度显著提高，纳米囊泡的检测分辨率也更高。荧光相关光谱（FCS）通过检测布朗运动中荧光标记粒子强度随时间的变化，也被用于研究外泌体的大小。
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表面等离子体共振（SPR）
表面等离子体共振（SPR）生物传感器是一种光学方法，它将特定的受体蛋白固定在涂有金或银纳米颗粒的活性表面上，从而能够对细胞外囊泡（exosome）表面的生物标志物进行灵敏、无标记且实时的检测。
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干涉反射成像（IRI）
单粒子干涉反射成像传感器（SP-IRIS）是一种用于分析单个外泌体的数字光学成像和测量技术。使用SP-IRIS可以通过多路复用方法同时进行纯囊泡的尺寸测定和蛋白质分析。
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电化学传感（ES）
电化学生物传感器是一种分析仪器，能够识别附着在外泌体生物标志物上的分子，如抗体和适配体。电化学传感现在能够检测低至100个外泌体/毫升的样本浓度。
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蛋白质印迹法（WB）
可以采用SDS-PAGE和免疫印迹法（WB）来确定分离出的外泌体。外泌体的蛋白质印迹分析基于在膜上表达和定位的常见生物标志物受体蛋白（例如 CD9、CD40、CD63、CD81和CD151）以及内化蛋白（如Tsg101、Hsp70、Hsp90和Alix）。在此方法中，蛋白质通过凝胶电泳分离，转移到膜上，并用特定抗体进行探针检测。然后，通过与已知抗原阳性和抗原阴性对照样本以及分子量梯度进行比较，最后利用成像系统对免疫反应带进行分析。
外泌体及其内容物对细胞间通讯的重要贡献得到了越来越多研究的支持。由于外泌体具有作为治疗性递送载体和非侵入性诊断生物标志物的潜力，它们在制药领域正成为一个热门的研究课题。尽管在高效分离、纯化、表征和药物负载方法等方面仍存在有待改进的挑战，但外泌体具有优越的特性，这有力地支持了其作为疾病治疗中早期诊断生物标志物和治疗性货物递送载体的巨大潜力。本综述概述了外泌体分离和表征中常用技术。外泌体研究是一个非常新的且迅速发展的领域。新方法的不断开发将使外泌体研究向治疗应用的转化变得更加容易。
