综述：牛奶外泌体在人类健康和疾病治疗中的多面手角色
一、前言
牛奶是人类饮食中最古老和最重要的食物之一，它就为新生哺乳动物提供生长所必须的营养，包括蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质。在世界各地的不同文化中，牛奶及其产品，如酸奶、奶酪和黄油，长期以来一直是日常饮食的重要组成部分。除了提供营养，牛奶还是多种具有生物活性分子的载体，这些分子对人类健康具有重要影响。这些包括免疫调节蛋白、成长因子，以及多种细胞外囊泡，包括外泌体，这其中外泌体被认为在细胞间通信和潜在治疗应用中具有核心作用。
外泌体是纳米级囊泡，几乎由所有真核细胞均可释放，当然牛乳腺也释放外泌体。这些囊泡是在细胞内部通过内涵体内膜的融合形成的，形成称为多囊泡体的结构。多囊泡体与质膜融合后，它们所含的外泌体被释放到细胞外空间。外泌体的双脂层富含胆固醇、蜡烷及鞘脂等脂质成分，它们负责外泌体的稳定性及其与靶细胞膜相互作用的能力。在脂双层内，还有特定的膜蛋白，包括四跨膜蛋白（例如，CD9、CD63 和 CD81），它们在外泌体与其他细胞膜的融合中发挥关键作用。此外，这些蛋白质是分子标记物，可以在不同实验方法中识别外泌体。
外泌体能够携带多种生物活性分子，使其成为细胞之间信息运输者。它们是细胞间通信的重要组成部分，其治疗和诊断潜力正吸引着越来越多研究者的兴趣。外泌体的载荷极其多样化，包括核酸在内的多种成分。在外泌体中，最丰富的核酸类型之一是微小RNA（miRNA）。微小RNA是一类短的非编码RNA分子，对于在转录后水平调节基因表达至关重要。它们在细胞增殖、细胞凋亡、免疫反应和代谢等多种生物过程中发挥着关键作用。在外泌体中发现的其他类型RNA包括信使RNA、核糖体RNA、长非编码RNA、转运RNA、小核RNA、小核仁RNA和piwi互作RNA，所有这些都影响着各种生物过程。除了RNA，外泌体还包含DNA、脂质（胆固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、神经酰胺和蜡质）、以及可以激活接受细胞中特定信号通路的蛋白质（跨膜蛋白、膜相关蛋白和被封闭在其腔体中的可溶性蛋白）。
外泌体最重要的机制是它们向其他细胞传递物质和信息的能力。外泌体可以通过三种主要方式与靶细胞相互作用：（1）它们可以通过受体-配体相互作用与靶细胞的细胞膜结合，从而导致特定信号通路的激活；（2）它们可以通过内吞作用被细胞摄取，使其内容物在细胞内部释放；（3）它们可以直接与靶细胞的细胞膜结合，使其内容物直接转移到细胞的细胞质中。
牛奶外泌体具有高生物相容性，这使得它们适合在各种医学领域有效使用。由于它们来自于牛奶的天然来源，而牛奶是人类饮食的一部分，这些结构在体内耐受性良好，没有显著的免疫反应。外泌体在不同生物环境中的高稳定性，例如胃肠道，进一步增强了它们的应用潜力。牛奶来源的外泌体能够在严酷的消化环境中存活，使它们能够穿透肠道屏障，达到身体的各种组织。
从牛奶中分离外泌体是研究它们及其潜在治疗应用的重要步骤。最常用的方法包括差速超离心、串联过滤、蔗糖梯度离心、体积排阻色谱、基于聚合物的外泌体沉淀试剂盒，以及一些先进技术，如切向流动过滤和颗粒纯化色谱。差速超离心目前被认为是外泌体分离的最佳方法，具有多项优点，包括高样品容量、大量外泌体的产量和低分离成本。然而，基于超离心的分离方法受到限制，因为酪蛋白会与外泌体颗粒共同沉淀。Weiskirchen等通过引入如EDTA等螯合剂来缓解这个问题，破坏酪蛋白聚集物并提高外泌体的纯度。这些进展不仅改善了外泌体分离物的纯度，还提高了下游分析的可靠性，如外泌体RNA、蛋白质和脂质载荷剖析。还探索了其他分离方法，以克服超离心的局限性。Ko et al.证明了使用振荡辅助切向流电泳过滤带有抗污染保护的微超滤膜过滤器，实现牛奶外泌体高质量纯化的可行性。这种方法减少了污染，提高了产量，但需要专用设备，限制了其可扩展性。Kaddour et al. 提出了使用分子筛的纯化方法结合高分辨率液相色谱的高效牛奶外泌体纯化方法。尽管此方法非常有效，但需要大量资源和专业知识，使其在常规应用中不太容易接触。选择分离方法在决定外泌体载荷的完整性和生物活性方面起着关键作用。超速离心法虽然能有效地分离大量外泌体，但常常使囊泡受到机械应力，这可能会损害其结构完整性，以及RNA、蛋白质和脂质货物的稳定性。相比之下，分子筛和免疫亲和捕获方法因其温和的处理条件而闻名于能保持外泌体货物的完整性。然而，这些方法通常产生的外泌体数量较少。基于沉淀的试剂盒提供了简单性和易用性，但常常导致较高的污染物水平，如蛋白质和聚合物残留，这可能会干扰载荷分析并降低功能研究的可靠性。未来的研究应集中于开发标准化、可扩展的分离方法，结合多种技术的优点，如超速离心和色谱，以提高外泌体分离物的重复性和纯度。
对于我们理解细胞间通讯和开发创新治疗策略方面，牛奶外泌体具有重要潜力。本篇叙述性综述提供牛奶外泌体的最新进展，重点关注其在各种病理状况和生理过程中的作用机制。我们优先考虑了过去十年内发表的经过同行评审的期刊文章，这些文章研究了牛奶外泌体的生物特性，特别是它们的组成、作用机制和潜在的治疗应用。
2、牛奶外泌体对肠道健康和功能的影响
牛奶外泌体在调节肠道健康方面显示出显著潜力，能够以多方面的方式影响肠道屏障功能、微生物组和炎症反应的调节。针对炎症性肠病（IBD）小鼠模型研究显示，饲喂缺乏牛奶外泌体的饮食的动物病症更为严重。通过小鼠的饮食口服牛外泌体后，基质坍塌、腺体增生以及附加的显微病理评分分别减少了56.7%、23.5%和29.6%。牛奶外泌体含有众多miRNA，包括miR-200a-3p，它在调节炎症反应中发挥着关键作用。小鼠模型增加牛奶外泌体之后，外泌体中的miR-200a-3p与CXCL9 mRNA结合，抑制其翻译，并减少趋化因子的生成，从而防止炎症相关的病理性变化。这项研究的结果表明，miR-200a-3p在调节炎症反应中发挥着重要作用，其缺乏可能会导致疾病加重。
在溃疡性结肠炎的小鼠模型研究中，牛奶外泌体被证明能够通过抑制TLR4-NF-κB通路和NLRP3炎症小体的活化来调节免疫反应。补充牛奶外泌体可以显著地减少了TLR4-NF-κB信号通路的关键成分的表达，包括TLR4、Myd88、COX2、磷酸化的IκBα和p65蛋白。类似地，NLRP3信号通路关键成分NLRP3、与凋亡相关的斑点样蛋白和前半胱天冬酶-1的在模型小鼠中的表达增加，在补充牛奶外泌体后，相关蛋白表达显著地减弱。这种对两个通路的综合抑制改善了肠道中的Treg-Th17平衡，减少了炎症细胞浸润和组织纤维化。
在Mun等人的结肠炎小鼠模型研究结果表明，牛奶外泌体中miRNA let-7a-5p下调细胞周期控制关键基因CDK6的表达。CDK6过度表达与异常细胞生长相关，这可能导致炎症。通过调节CDK6的表达，牛奶外泌体可能有助于恢复正常的细胞增殖，这对减轻炎症反应至关重要。Mun等人也证明，补充牛奶外泌体能够促进阿克曼氏菌的微生物丰度（已知能支持肠道屏障和减少炎症）以及β-羟基丁酸的丰富度（一种具有强大抗炎特性的短链脂肪酸，有助于减少炎症过程并促进肠道组织修复过程）。Du等人在同样的结肠炎小鼠模型的研究结果表明，补充牛奶外泌体显著地影响肠道中的脂质和氨基酸代谢。代谢组学分析揭示，牛奶外泌体调节了因炎症而扰乱的代谢物水平。外泌体处理增加了二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸（脂质代谢物）的水平，它们以其降低炎症的作用而闻名。
牛奶外泌体还具有保护和恢复肠道屏障完整性的能力。在一种营养不良的小鼠模型研究中，补充牛奶外泌体促进肠道细胞增殖增加和肠绒毛结构改善，这有助于上皮再生和肠道屏障完整性的恢复。牛奶外泌体与Wnt信号通路的激活有关，通过上调了Lgr5基因的表达，刺激了肠道隐窝中的干细胞活性，并促进了组织修复。此外，补充牛奶外泌体显著地增加了肠道上皮中关键紧密连接蛋白claudin-3的表达，从而进一步加强了肠道屏障及其保护作用。Tong等人的研究结果显示，牛奶外泌体显著地改善了体外（肠上皮细胞）和体内（小鼠）模型中上皮紧密连接的完整性。牛奶外泌体上调了关键紧密连接蛋白的表达，这有助于维持肠道屏障的完整性。牛乳外泌体还降低了促炎细胞因子（如IL-6和TNF-α）的水平，提高了抗炎细胞因子IL-10的水平。
除了免疫和结构方面的益处外，牛奶外泌体可能还会影响肠道微生物组的组成。牛奶外泌体会增加有益细菌的丰度，这些微生物组组成的变化与肠道屏障功能和免疫调节重要基因的表达显著增加相关。牛奶外泌体治疗与短链脂肪酸（包括丁酸和乙酸）的生成增加相关，这些短链脂肪酸对维持肠道稳态和抑制炎症反应至关重要。
总而言之，越来越多的证据表明，牛奶外泌体通过多种分子机制及与微生物群的相互作用在调节肠道健康方面发挥着关键作用。外泌体通过调节炎症反应、抑制关键信号通路（如TLR4-NF-κB）和激活肠上皮的修复机制（如Wnt通路）发挥作用。值得注意的是，这些外泌体中的miRNA，如miR-200a-3p和let-7a-5p，调节改善肠屏障完整性和免疫稳态的关键基因的表达，如CXCL9、CDK6或Muc2。牛乳外泌体对肠道微生物群也有显著影响，促进有益细菌的生长，如阿克曼氏菌和双歧杆菌，同时限制病原体的发展。
3. 牛乳外泌体对神经系统功能和发育的影响
牛奶外泌体已经成为神经系统发育的重要调节因子，研究表明它们对小鼠的认知、神经元和感觉运动功能有影响。在Mutai等人的研究中，缺乏牛乳外泌体的饮食的小鼠在学习和空间能力方面表现出明显下降，尤其是在年轻动物中。此外，缺乏牛奶外泌体的饮食的小鼠对感官刺激的反应显著降低，表现为对声学刺激的过滤问题。对海马组织中基因表达的分析显示，与神经信号传递相关的基因（包括参与轴突引导和钙信号传递的基因）下调了，这可能解释了观察到的认知缺陷。
进一步研究发现，采用补充牛奶外泌体的小鼠在学习和空间记忆任务（通过巴恩斯迷宫评估）中的表现显著优于采用缺少牛奶外泌体的小鼠。这些小鼠在海马神经元中也表现出明显减少的树突复杂性，表明神经元发育受损。除了认知受损外，缺少牛奶外泌体的饮食的小鼠对卡酸诱导的癫痫发作的易感性显著增加，癫痫发作的严重程度评分比补充牛奶外泌体饮食的小鼠高出五倍。接受牛奶外泌体饮食的母鼠的后代在学习和记忆技能方面表现更好，海马中的树突发育也更完善，相较于接受缺少乳源外泌体饮食母鼠的后代，幼鼠的结果更佳，海马体内的树突也更为发达。年轻小鼠在巴恩斯迷宫测试中取得了更好的结果，海马区域的神经元复杂性更高，这表明乳制品外泌体对大脑发育有益。相反，缺少乳源外泌体的母亲的后代在认知能力方面表现出显著缺陷，包括学习和记忆方面的困难。他们的海马体树突复杂性减少，并且对癫痫发作的敏感性增加。这些研究结果表明，牛奶外泌体在神经元发育和提高成年小鼠及其后代的认知功能中发挥了关键作用。由于外泌体中的微小RNA序列在哺乳动物中高度保守，可以假设类似的效应可能在不同物种中发生，包括人类。该领域的更多研究可能有助于制定未来有关婴儿营养和早期神经发育干预的建议。
4，牛奶外泌体对骨骼健康和再生的影响
骨质疏松症以骨量丧失和结构恶化为特征，是最常见的代谢性骨疾病之一，尤其在老年人群中十分普遍。其发病机制涉及两种细胞类型之间的失衡：成骨细胞负责骨形成，而破骨细胞则负责骨吸收。近年来，补充牛奶外泌体已被证明对骨骼健康有益。
体外研究的结果表明，牛奶外泌体促进间充质干细胞向成骨细胞的分化，促进了成骨细胞的增殖，并加速了成骨生成。这些结果在体内研究中得到了进一步验证。在糖皮质激素诱导的骨质疏松小鼠模型中，口服牛奶外泌体可以防止骨量流失，并维持股骨的骨小梁微结构。与对照组相比，牛奶外泌体治疗导致骨矿物质密度和骨体积百分比显著增加，从而逆转了糖皮质激素诱导的骨质疏松症的影响。此外，牛奶外泌体对肠道微生物群的有益影响，这可能表明存在影响骨代谢的肠-骨轴。特别是，乳酸杆菌和拟杆菌在骨质疏松模型组中显著减少，而在接受牛奶外泌体治疗的动物中，这些细菌的水平恢复到了与对照组相似的水平。
卵巢切除诱导的骨质疏松小鼠模型的研究中发现，牛奶外泌体也显示出对骨组织的保护作用。口服牛奶外泌体有效抑制了破骨细胞分化，改善了骨微观结构，并恢复了骨质疏松生物标志物的水平。与未接受治疗的骨质疏松动物相比，口服牛奶外泌体的小鼠的骨小梁厚度和骨矿物质密度增加。口服牛奶外泌体还改善了肠道屏障功能，并调节了肠道微生物群，特别是通过增加与短链脂肪酸（包括乙酸和丙酸）生产相关的拟杆菌丰度。这些短链脂肪酸在维持肠道稳态和支持骨骼健康中发挥着关键作用。此外，外泌体治疗显著降低了促炎细胞因子TNF-α和IL-17的水平，同时增加了抗炎细胞因子IL-10，从而减少炎症并促进骨修复。
在另一项同样模型研究显示，口服外泌体改善了小鼠股骨的刚度和微结构，减少了破骨细胞的数量，并降低了血清和骨骼中的RANKL/OPG比例。RANKL/OPG比例是骨吸收与形成之间平衡的关键指标，因为RANKL刺激破骨细胞分化并增强骨骼降解，而OPG作为其天然抑制剂，防止破骨细胞活化。补充牛奶外泌体增加了骨细胞和成骨细胞的数量，表明它们对雌激素缺乏小鼠的骨再生具有有益影响。有趣的是，外泌体对骨健康的有益影响在因高碳水化合物饮食而肥胖的小鼠中也得到了证明。肥胖小鼠显示出骨质流失的迹象，而补充牛奶外泌体逆转了这些变化，改善了骨健康。此外，高碳水化合物饮食的小鼠RANKL水平和RANKL/OPG比值升高。外泌体治疗使这些骨参数恢复到接近对照水平。
总而言之，牛奶外泌体对骨骼健康具有显著影响，能够保护骨骼免受丧失，并调节与骨代谢相关的细胞和分子过程。这种影响可能与对骨细胞的直接作用以及通过肠道-骨轴的间接调节有关。
5. 牛奶外泌体对皮肤再生和毛发生长的影响
牛奶外泌体显示出改善皮肤水分和减少皱纹的潜力。牛奶外泌体可以被角质形成细胞和成纤维细胞直接摄取，在这些细胞中，它们改善了皮肤水分调节和结构完整性相关的重要基因的表达。增加这些蛋白质的表达可以更有效的水分保持和皮肤屏障的增强。此外，牛奶外泌体减轻了紫外线照射导致的成纤维细胞中胶原蛋白I型和III型的减少，支持了皮肤再生。一项人体研究显示，外泌体使皮肤水分提高了5.6%，尤其是在年龄较大的参与者组中，并减少了4.99%的皱纹数量。此外，牛奶外泌体改善了皮肤弹性并减少了皱纹面积，这表明其抗衰老潜力。在动物研究中，牛奶外泌体被用于皮肤过敏、光过敏、反复刺激和光刺激的测试。所有测试均显示牛奶外泌体应用非常安全。在对志愿者进行的后续研究中，均未显示出任何不良皮肤反应。
牛奶外泌体一个引人注目的能力是调节黑色素生成的能力。黑色素生成是负责黑色素产生和皮肤色素沉着的过程。对小鼠黑色素瘤细胞和人类黑色素细胞的体外研究表明，牛奶外泌体中的microRNA-2478抑制Rap1a的表达，Rap1a对黑色素的生产至关重要。抑制Rap1a会破坏PI3K/Akt通路，导致酪氨酸酶活性降低和黑色素生产减少，导致皮肤变白。这些发现表明，牛奶外泌体可能成为化妆品特别是具有美白效果的化妆品的重要组成部分，因为它们具有低细胞毒性和高生物相容性。
此外，牛奶外泌体在促进毛发生长方面具有显著潜力。针对调节毛囊周期的人类真皮乳头细胞的体外研究表明，牛奶外泌体以浓度依赖的方式显著增强了乳头细胞的增殖。重要的是，这些外泌体还能够克服二氢睾酮（雄性脱发的主要原因）对乳头细胞增殖的抑制效应，这表明它们在治疗脱发方面的潜力。在小鼠的研究中，使用外泌体导致显著的毛发生长，与广泛使用的防脱发药物米诺地尔相比，约在13天内实现了50%的毛发覆盖率。组织学分析表明，外泌体加速了毛囊从休止期（telogen）到生长期（anagen）的过渡，主要是通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路实现的，该通路通过增加β-连环蛋白（提高1.5倍）和Wnt3a的表达来上调，刺激DP细胞增殖并支持毛发生长。外泌体没有引起炎症，突显了它们作为更安全治疗替代品的潜力。这些结果表明，牛奶外泌体在毛发再生治疗中具有良好的前景，为安全有效地治疗脱发开辟了新的可能性。
6.牛奶外泌体的其他作用
6.1牛奶外泌体抗氧化作用
牛奶外泌体可以保护细胞免受氧化应激，这在使用IEC-6肠道细胞模型的研究中得到了证实。牛奶外泌体可以作为一种有效的保护因子，通过调节嘌呤代谢、能量状态和细胞信号传导，在氧化应激条件下支持细胞再生。
6.2 牛奶外泌体的免疫调节作用
在研究牛奶外泌体的免疫调节特性时，实验是在健康成人参与者中进行的。研究表明，牛奶外泌体可能通过在特定刺激条件下增强免疫细胞的活性来调节免疫反应。
6.3 牛奶外泌体在纤维化中的治疗潜力
牛奶外泌体在心脏纤维化治疗中也显示出良好的治疗潜力。在Zhang等人的研究表明口服牛奶外泌体促进小鼠模型的新血管生成，减少纤维化。此外，牛外泌体刺激了人脐静脉内皮细胞增殖（增加38%）、迁移（增加45%）和新生血管化（增加41%）。口服牛奶外泌体可能通过促进血管生成来减轻心脏纤维化，并支持受损组织的再生。由于纤维化是影响多个器官（包括肺、肝和肾）的挑战性疾病，牛奶外泌体在减轻心脏纤维化方面的有效性为其他组织的纤维化提供了潜在的治疗方法。
7.牛奶外泌体的潜在负作用
尽管牛奶衍生的外泌体作为治疗剂具有很大的潜力，但它们的潜在副作用必须谨慎评估。虽然这些分子可以提供治疗益处，但它们也有可能干扰非目标细胞的生理通路。此外，牛奶衍生的外泌体理论上可能会促进肿瘤的生长或进展，正如已有观察所示。这种潜力源于它们能够传递促进细胞增殖或改变肿瘤微环境的生物分子。另一个关注点是外泌体在体内的潜在聚集，特别是在高剂量情况下。聚集可能加速免疫清除或导致局部不良影响，正如在临床前研究中所示。乳制品来源的外泌体代表了治疗开发的一个有前景的途径，但它们的潜在副作用需要仔细调查别是在调节免疫系统、长期系统性影响以及与已有疾病或感染的相互作用方面。
8.挑战与未来
外泌体是天然的生物活性分子的载体，可以影响关键的生物过程，包括基因表达的调控。在过去的二十年里，外泌体的研究取得了重大进展。大多数研究集中在来自人类细胞的外泌体上，因为内源性来源和组织相容性使其成为理想的治疗应用候选者。最近，牛奶外泌体作为一个有前景的研究领域开始受到关注。体外和体内研究的结果表明，牛奶外泌体可能成为医学应用中的一个宝贵工具，特别是在各种疾病的治疗中。牛奶外泌体表现出高生物相容性和最小的系统毒性，并且在供应上丰富、生产成本低且没有伦理问题，这使得其成为人源外泌体的一个有吸引力的替代选择。然而，在治疗策略中应用牛奶来源的外泌体临床时，需要解决一系列科学、技术和监管的挑战，以实现其全部潜力。
这个领域面临的一个关键挑战似乎是通过标准化外泌体的分离和纯化过程，确保批次之间的一致性。这些纳米颗粒的天然来源，加上它们的异质性和来源的多样性，使得获得一致的生产批次变得困难。牛奶来源的外泌体在大小、成分和生物活性方面表现出显著的变化，原因包括牛的品种、饲养方案或养殖条件。目前的方法，包括超离心和聚合物沉淀，既耗时又昂贵，并且不是很具可扩展性。最近的努力集中在纯化和生产的重复性，同时这些方法需要进一步验证以确保其可靠性。因此，开发可靠的方法以确保外泌体成分和功能的一致性是至关重要的。
另一个重要方面是质量控制和潜在污染物的去除。牛奶外泌体可能含有不良成分，例如宿主蛋白或DNA残留物，这可能引发不必要的免疫反应，对临床安全构成重大风险。实施严格的质量控制程序和建立全面的监管标准对于降低这些风险至关重要。此外，尽管来源于牛奶的外泌体具有较低的毒性，但仍需进行长期的临床前研究来评估其安全性和毒性。确保外泌体在体内的稳定性是另一个关键挑战。外源性外泌体在循环系统中迅速被清除，显著限制了它们的治疗效果。
尽管面临这些挑战，牛奶外泌体可能为精准医学提供机会，成为开发个性化疗法的经济实惠且可扩展的平台。随着持续的研究和技术进步，它们可能成为未来治疗干预的关键组成部分。目前的研究，主要集中在牛奶来源外泌体的治疗潜力上，特别是在肠道健康、神经系统功能、骨再生、皮肤修复和头发生长等与疾病相关的应用中。然而，关于外泌体的未来研究有许多方向。其中一个有前景的方向是它们在功能性和药用食品中的应用以及新饮食指南的制定。未来，牛奶来源外泌体可能成为改善人类健康的创新营养解决方案的重要组成部分。
