【文献推送】J. Am. Chem. Soc. |外泌体表面糖基化RNA的定位分析
今天与大家分享一篇发表于JACS的工作，题目为“Mapping GlycoRNAs on an Exosomal Surface”，文章的通讯作者为美国匹兹堡大学的Subhadip Ghatak。
糖基化RNA（glycoRNAs）作为表观遗传组学的新兴研究方向，打破了RNA仅能承担蛋白质合成等基础功能的传统认知。此前的研究已经证实了细胞表面糖基化RNA的存在，但内体来源的外泌体表面是否存在这类物质、其结构特征及生理功能均未明确。这篇工作开发了一种高碘酸盐氧化-肟连接结合RNA染料或分子信标的检测方法，无需依赖代谢标记即可实现对外泌体表面糖基化RNA的精准定位与分析。
研究首先采用差速超速离心结合免疫磁珠分选法，从人角质形成细胞条件培养基中分离出外泌体，随后采用膜通透性的SYTO Green（RNA染料）和膜不透性的TOTO-1（核酸染料）进行差异化标记。分析结果表明，约29%的外泌体表面存在核酸信号，经DNase I处理后荧光仅微弱下降，说明表面核酸以双链RNA为主。进一步采用RNase A处理后，同时带有RNA和聚糖标记的信号显著下降，而游离聚糖信号无明显变化，说明聚糖主要共价结合在单链或发夹结构的RNA区域。
鉴于miR-21在伤口炎症消退中具有关键的调控作用，研究进一步聚焦外泌体表面的pre-miR-21，并发现伤口边缘组织来源的外泌体中的miRNA-21a-5p丰度显著高于未损伤皮肤中的外泌体。序列比对显示，pre-miRNA-21的茎环结构中含有外泌体装载RNA的关键EXOmotif序列，而成熟miR-21不具备该序列。研究进一步设计了靶向茎环区域的分子信标，联合外泌体跨膜蛋白标记染料、聚糖标记染料对外泌体进行三重荧光标记。超分辨成像结果显示，青色的pre-miR-21信号与红色的聚糖信号空间位置紧密相连，且都远离绿色的外泌体核心信号，证明外泌体表面的pre-miR-21存在糖基化修饰。
基于团队前期发现的糖尿病状态下外泌体功能受损、巨噬细胞摄取效率下降的现象，研究推测糖尿病可能会改变外泌体表面的糖基化修饰模式。研究发现，非糖尿病小鼠的外泌体表面糖基化RNA和糖基化pre-miR-21丰度显著高于糖尿病小鼠，提示糖尿病状态下外泌体表面糖基化RNA的减少可能是导致外泌体功能异常、伤口炎症难以消退的原因。
为明确糖基化RNA在巨噬细胞摄取外泌体过程中的作用，研究采用能够特异性切除N-聚糖的PNGase F处理外泌体，经染料标记后与巨噬细胞共孵育。活细胞成像显示，对照组外泌体可被巨噬细胞大量内化，而PNGase F处理组的外泌体仅黏附在细胞表面。荧光强度追踪表明，对照组荧光信号随时间持续升高，而PNGase F处理组始终维持在低水平。Z-stack分层扫描进一步证实，对照组外泌体可深入巨噬细胞内部约9 μm，而处理组外泌体仅停留在细胞表面，说明外泌体表面的糖基化RNA是介导巨噬细胞摄取的关键分子。
有研究表明，哺乳动物small RNA会在acp3U位点发生N-糖基化，本研究进一步发现，这一修饰是由DTWD2酶催化完成的。研究在人角质层形成细胞中分别转染DTWD2敲除和对照质粒，培养后分离外泌体进行成像分析。其中，对照组外泌体可见清晰的聚糖-pre-miRNA-21共定位信号，而DTWD2敲除组的这一信号几乎完全消失。于是，研究进一步提出外泌体表面糖基化RNA的结构模型，认为RNA双链区域被蛋白或脂质屏蔽，单链/发夹区暴露并通过acp3U与聚糖共价结合，这种结构既保护RNA免受降解，又能作为识别标签介导细胞间通讯，同时屏蔽RNA的免疫原性，避免激活先天免疫反应。
总结来说，这篇文章通过创新检测方法，首次证实了内体来源的外泌体表面存在共价连接的糖基化RNA，并解析了其结构特征、修饰机制和生理功能，揭开了糖尿病状态下糖基化RNA丰度降低是导致伤口难愈合的重要原因，为糖尿病慢性伤口等疾病的治疗提供了全新的潜在靶点。
