【好文导读】外泌体表面上的糖RNA定位

本研究引入了一种创新的周期氧化和环糖连接（OL）方法，结合RNA结合染料或分子信标（MB），用于检测内分泌体外泌体表面上的糖RNA，解决了外泌体纳米级尺寸和缺乏合适检测技术带来的挑战。该方法实现了直接糖链-RNA连接的鉴定，有望推动我们对糖RNA生物学的理解。该方法通过序列双标记方法验证了特异性和灵敏性，该方法区分了外泌体表面结合的糖RNA，这一点通过流式细胞术和直接随机光学重建显微镜（dSTORM）得到证实。此外，利用核糖核酸酶和肽N-糖苷酶F（PNGase F）进行的酶治疗揭示了糖链修饰的位置和稳定性，表明糖RNA在细胞吸收中对有效细胞间通讯具有重要作用。该方法不仅绕过了代谢化学报告器的需求，还为探索未知糖RNA序列奠定了基础，将研究范围扩展到唾液酸之外，从而拓宽表观转录组学的范围，并提供潜在的治疗见解。

介绍

除了蛋白质合成的传统功能外，核糖核酸（RNA）及其修饰为表转录组学领域注入了新活力。(1,2)几十年前发现的RNA转录后修饰显著提升了其化学多样性和功能，超越了其传统信使分子的角色。(3,4)尽管表转录组中发现了广泛的转录后RNA修饰，但碳水化合物连锁的证据仅限于tRNA中的单糖修饰。(5,6)最近发现了细胞表面含有唾液酸和褐糖糖基化的RNA，这进一步加深了我们对RNA修饰在多种生物过程中复杂性的理解，包括分子识别和细胞信号传导。(7,8)糖RNA包括小核（sn）RNA、核糖体（r）RNA、小核细胞RNA（sno）RNA、转移（t）RNA和反反糖键（Ro-Associated Y）RNA，后者占糖基化RNA物种中比例最高的。(7,9)与脂质和蛋白质不同，RNA从未被视为糖基化的靶点。(10)然而，细胞表面发现的糖基化RNA（称为糖RNA）支持了RNA也能参与细胞间通信的观点，而此前人们认为RNA无法参与这一角色。（10−12）

我们之前的研究表明，受伤后，常驻表皮角蛋白细胞与血源性创伤部位巨噬细胞（mΦ）之间通过角蛋白细胞来源（Exo）实现双向交互作用κ）和mΦ起源（Exo）mΦ）外泌体在炎症缓解中起着关键作用。(13,14)与未受伤皮肤相比，伤口边缘（WE;距边缘< 2毫米）富含糖基化的外泌物κ这些基因通过N-糖链介导的摄取机制优先被伤口位点mΦ内吞。(14)这样的Exoκ还显示出大量小血压RNA（<200碱基对），这些RNA对于缓解伤口炎症和恢复修复皮肤的屏障功能至关重要。(14)现有文献表明，外泌体携带其母细胞的分子特征。(15,16)不同于起源于细胞膜的外泌体（17−20）并且更可能在表面携带糖RNA，我们验证了RNA分子可能也锚定在内分泌体外显体上的假说，超越了RNA被封装在外泌体中的既有理解。如果这一假说成立，那么这些表面RNA可能像细胞表面的糖RNA一样被糖基化。

结果与讨论

外泌体表面上与糖链相关的双股RNA检测

在这项工作中，按照MISEV 2023指南，采用差异超离心法和免疫磁分离法，从培养的人类角质细胞的调控培养基中分离出外泌体。(21)正如我们之前所述（EV赛道编号：190103;该方法在获得EV指标得分100%的EV赛道中报告。(14)为确保特异性，进行了对照实验，将外泌体与仅用珠子以及含氨基氧和TOTO-1染料的珠子一起孵育。这些对照组显示荧光没有变化，有效排除了通过吸附作用与珠子非特异性结合的可能性（图S1A).为研究外显体表面上的RNA存在，我们采用了膜透透的SYTO RNASelect Green核酸染色，该染色对RNA具有选择性，以及膜非透透的噻唑橙同调剂（TOTO-1）荧光RNA结合染色（图1定量的珠流细胞术分析表明，15–35%的双链核酸（推测为前miRNA）定位于外泌体表面（图1B，C）。由于TOTO-1结合双链RNA和DNA，(22,23)理解DNA和RNA在外骨骼中的主导地位至关重要κ表面。DNase I处理显示TOTO-1荧光略有下降，表明外泌酶上双链RNA（dsRNA）占主导地位κ表面（图S1B–D).

与DNA不同，RNA的核糖使RNA更不稳定且易降解。除了在各种脱水组织类型中报告的长期RNA持久性（从数天到数年不等），主要在法医领域，（24−31）除非有其他生物分子保护，否则RNA在生理环境中的稳定性存疑。因此，这一观察引发了两个开创性问题：这些外泌体表面的RNA是否被糖链保护，形成糖RNA？如果它们确实存在于外泌体表面，那么它们在细胞间的生理意义是什么？

多种方法已被用于检测和表征细胞表面的糖RNA。(8,32,33)如点击化学的RNA印迹和代谢标记等技术已确认细胞表面存在糖RNA。(7)通过影像学和近距离标记，利用针对dsRNA或凝集素等糖链结合蛋白的抗体，进一步验证了相关信息。(34)随后，利用磁珠富集代谢标记的糖RNA，促进了通过下一代测序的分析。(35,36)同时，质谱结合高效液相色谱（HPLC）被用于阐明附着糖链的结构和组成。（37−39）尽管基于LC-MS和CE-MS的细胞表面和外泌体N-糖链剖析取得了重大进展，包括近期的毛细管电泳-质谱方法，这些方法仍缺乏直接将糖链结构分配到RNA支架所需的特异性，尽管检测到的部分糖链很可能起源于细胞或囊泡相关的miRNA。(32,40,41)一种新颖的方法，如ARPLA(32)（唾液酸适配体和RNA原位杂交介导近接连接测定）在检测未知序列的糖RNA方面也有一定的用处。(42,43)这是因为ARPLA采用唾液酸适体进行糖链识别，并采用寡核探针进行糖RNA原位杂交，这需要先知糖RNA序列以实现高选择性和灵敏性。（42,44−46）利用N-azido乙酰氨基氨基甲基甲基乙酰乙酰化物（Ac4ManNAz），一种特异性于唾液酸的代谢化学报告剂（MCR），糖RNA的发现已显著进展。(7,47)AC的成立4ManNAz利用方济多基的反应性进行双正交标记，使用无铜的点击试剂，在生物合成过程中整合入唾液酸。(48)而AC4ManNAz促进了糖RNA研究的重大进展，其应用仅限于能够在生物合成过程中整合该代谢报告蛋白的代谢活性细胞。(49)这一限制限制了MCR在转化研究中的应用，因为在临床样本中，报告者不切实际地进行管理。(49)

由于外泌体的纳米级尺寸，表面糖RNA的检测大多未被充分探索，受限于缺乏合适的工具和可视化技术。(11)外泌体虽然起源于内体，但本质上类似于质膜，这表明通过代谢糖链工程结合双正交点击化学实现其功能化的可能性。(50,51)在本研究中，我们引入了一种简单、灵敏且高效的方法，利用周期氧化和醛连接检测外泌体表面的糖链，从而绕过了对MCR的需求。该方法结合RNA染色剂与糖链标记结合，检测外泌体表面可能存在与糖链（糖RNA）修饰的RNA。唾液酸中的7′-和8′-二醇特别活泼，在含有周期酸盐的生理性或轻酸性pH下迅速氧化为醛。这些外泌体表面的醛基团随后与氨基氧官能化的640R分子结合，形成稳定的氧结合，从而促进了外泌体膜糖RNA谱的可视化和分析。(33)这种标记策略对外泌体的形态、表面电荷和大小没有影响（图S2A–C). 然而，钠盐周期酸盐在轻酸条件下氧化顺二醇基团对RNA稳定性构成重大挑战。为评估钠盐周期酸处理对RNA完整性的影响，我们设计了具有相同碱序列的单链和双链寡核苷酸（图S3A). 通过高分辨率自动电泳分析了这些序列在盐周期处理后的完整性（图S3B). 结果表明，虽然单链RNA（ssRNA）稳定性显著受损，但dsRNA未发生变化（图S3C，D). 这表明盐酸钠处理后检测到的TOTO-1荧光可归因于dsRNA，支持前miRNA在外泌体表面大量存在的观点。

通过直接随机光学重建显微镜（dSTORM）结合四司他素标记CD9、CD63和CD81，进一步验证了这种两步糖链标记方法的特异性。该方法学方法既保证了糖链检测的特异性，也确保这些生物分子在外泌体表面的精确定位（图S4A–C). 使用氨氧官能化的640R Exo进行珠流细胞术分析κTOTO-1 证明了30%的RNA被糖基化并附着在外相膜上。为评估外泌体内RNA–糖链结合是否涉及非共价相互作用，我们用盐酸胍（GdnHCl）预处理囊泡，这是一种混效性药物，能破坏氢键、离子相互作用和疏水结合而不切断共价键。GdnHCl处理后RNA–糖链双重信号的持续性表明RNA与糖链之间通过共价键连接（图S5A、B). 为进一步严谨，我们用核糖核酸酶A（RNase A）在37°C下消化糖RNA的RNA，该酶选择性切割紧邻嘧啶残基的ssRNA中的P–O5′键。RNase A处理可将糖RNA信号去除约75%，从而提出Exo表面的糖链κ与单链RNA或发夹RNA的环状结构结合（图1D，E）。游离糖链信号基本未受影响（图1此外，糖RNA信号在蛋白酶K处理下也未受影响（图S5C，D).

观察结果的差异令人耐人寻味，尽管盐酸钠氧化顺式二醇基团并未降低荧光信号，但RNase A处理后该信号显著消失。这一明显矛盾促使严格研究以确认RNA在外泌体表面的结构取向。为此，我们采用了抗dsRNA单克隆J2抗体，该抗体被认为是dsRNA检测的金标准。（52−55）与我们假设不会观察到双阳性外泌体相反，我们的分析显示，外泌体表面约28%的RNA对TOTO-1和J2均呈阳性，而约32%对J2呈阳性（图S6).基于这一观察，考虑其核酸结构非常重要。TOTO-1作为夹层氰化染料，广泛结合任何双股结构中的碱基对区域，包括茎环发夹、前miRNA中间体或全双链RNA（dsRNA）。其荧光增强反映了碱基堆积和螺旋完整性的程度，而非序列或生物起源，因此作为RNA中双螺旋结构域的通用指示。相比之下，J2单克隆抗体识别的最小双股长度为约40碱基对的扩展A形螺旋dsRNA，与复制或免疫性RNA物种相关，且对含有膨起或不完美配对的短干环或前miRNA结构表现出极低的亲和力。因此，它们信号重叠的有无可以区分结构化的典型长dsRNA（TOTO-1/J2）区域，或免疫反应性双链RNA（dsRNA）的存在，后者是紧密排列的A型dsRNA，可能被蛋白质或脂质保护，或构象上无法通过染料插入（++图S6).

外泌体前体miR-21的表面糖基化使炎症信号传导成为可能

我们团队及其他团队的最新研究认识到miR-21是mΦ生物学和炎症过程的重要调控因子。（56−60）我们的研究首次证明，源自伤口部位角蛋白细胞的外泌体导源miR-21被输送到伤口mΦ，有助于缓解炎症。(59)从第2天（D2）小鼠WE组织和未受伤皮肤中分离出角蛋白细胞来源的外泌体，(61)结果显示了在（Exo）中miR-21的显著丰度κ) (图2答）。然而，一个重要重要因素常被主流出版物忽视，即多项研究报告基于RT-qPCR检测的外泌体中成熟的miR-21，这些检测方法也识别出前miR-21。值得注意的是，市面上用于miRNA cDNA制备的miR-21引物还能扩增miR-21前的miR-21a-5p区域。迄今为止，这些文献尚未完全排除前miR-21的存在，因此可能干扰了他们对外泌体中成熟miR-21的解释。对前体（前体）和成熟miR-21（也称为miR-21a-5p）EXOmotif序列的深入分析显示，虽然成熟miR-21没有EXOmotif序列，但pre-miR-21的茎环结构中存在EXOmotif，这支持了外泌体负荷（图2B）。此外，前miR-21作为货物比成熟的miR-21更稳定。(62,63)以往的研究记录了细胞表面的糖RNA仅与较小的RNA（<200碱基对）群体分馏。(7)鉴于pre-miR-21中存在的EXOmotif序列大小为<200碱基对，且糖链在小RNA上占优势，(7)发夹结构易于糖基化，且其在细胞间交互作用中的重要性，因此具有发夹结构的前miR-21很可能在外泌体表面被糖基化，以实现细胞间有效通讯(5,14)

研究Exo上pre-miR-21的存在κ表面，我们设计了一个分子信标（MB），其与发夹区域的结合序列互补（图2C）。MB在5′端标记有Cy5荧光团。与MB5′端互补的寡核苷酸在3′端有一个黑洞淬灭器3（BHQ3）（称为淬灭寡核苷酸），并会部分杂交形成MB（图2D）。该MB设计确保了与成熟miR-21相比，对前miR-21具有更高的选择性。小鼠Exo表面糖化的pre-miR-21丰度κ从D2 WE组织分离出的，采用dSTORM纳米成像结合MB结合糖链标记进行分析。糖链定位位于MB信号附近，远离核心四斯潘素定位，这导致了exo上的pre-miR-21这一观点κ表面被糖基化（图2E、F 和第七季).为确保严谨性，利用珠流细胞术验证了MB膜不透性（图S8A、B).人类角质细胞通过使用商业化的XMIR技术（XmiR-21-5p）将miR-21-5p封装在外泌体中，转染miR-21-5p。与XmiR-21-5p的转染增加了培养基中分离的细胞和外泌体中miR-21-5p的丰度（图S8C，D). 定量的珠状流式细胞术分析显示白金白蛋白荧光强度无变化，显示白金白蛋白的不透性（图S8E). 同样，确保RNase活性完全是表面现象是明智的。RNase A本身不具备膜通透性;然而，在恶性细胞中与负带电脂质双层相互作用等条件下，通过与阳离子肽的结合或二聚化等修饰，可以使其穿越脂质膜。(55)因此，这些转染XmiR-21-5p的外泌体接受RNase A处理，以确保其膜不透性。未观察到miR-21-5p转录本丰度变化（图S8F），表明本研究中使用的RNase A不会降解包裹在外泌体中的RNA。

该信号的灵敏度还被用来评估外泌体表面上N连接糖链的存在，方法是利用PNG酶F。PNG酶F切割N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）与N-连接糖蛋白中高甘露糖、杂交和复杂糖链的天冬酰胺残基之间的N连接糖链。(64)这导致去氨肽或蛋白质和游离糖链。我们采用PNGase F作为决定性干预，去除一整类糖链，从根本上改变外泌体上的抗原表达，同时保持囊泡完整性以供后续功能研究使用。我们的研究结果表明，PNG酶F处理使N-糖链的消化率约为60%（图S9A). 有趣的是，PNGase F处理还有效去除了糖RNA信号以及游离糖链，表明N-糖链与RNA之间存在复杂的联系（图S9B，C). 然而，PNGase F处理后残留糖链信号可能归因于O糖、糖蛋白和糖鞘脂。对于O糖和糖脂，需要更多破坏性的化学处理，可能影响囊泡完整性。由于缺乏共同核心结构和通用释放O糖的酶，O糖结构研究一直具有挑战性，这与N糖链的PNG酶F不同。利用酶标记，我们定量了外在体表面的O糖，发现其占比例约为20%（图S10). 因此，残留约20%的RNA信号可能来自于与O-糖链结合的RNA，尽管不能排除O-糖链与蛋白质或其他生物分子结合的可能性。

糖尿病条件下角蛋白细胞来源外泌体上的外泌体糖RNA丧失

我们之前的工作已经证明了Exoκ在糖尿病中表现出功能障碍，表面修饰减少了其被血液传播的mΦ吸收。(65)基于这些发现，我们假设Exoκ在糖尿病条件下，表面糖基化/糖基化有所不同。研究外泌体上糖RNA的分布和丰度κ，我们隔离出了Exoκ来自糖尿病DB/DB小鼠及其杂合非糖尿病同窝（m/db）D2损伤后D2的WE组织。与非糖尿病m/db小鼠不同，Exo的丰度++κ糖尿病DB/DB小鼠的检测结果显著偏低（图S11A).孤立的Exoκ两组的特征均为其尺寸和表层电荷。The Exoκ糖尿病小鼠的体型大于非糖尿病对照组的同窝（图S11B，C).这归因于可能的聚集，纳米颗粒跟踪分析（NTA）中出现多个峰值。然而，糖尿病Exo的ζ潜力κ显著高于非糖尿病的Exoκ，类似于我们在人类糖尿病患者中观察到的慢性伤口（图S11D).(65)糖RNA丰度通过珠流式细胞术和TOTO-1染料和氧化糖连接（OL）策略进行糖链标记定量。非糖尿病和糖尿病Exo小鼠的糖RNA丰度分别为62%和7.2%κ分别 （图3A，B）。我们分析了外骨骼上糖基化前miR-21的分布κM+/dB和DB/dB小鼠的表面。定量的珠状流式细胞术显示，非糖尿病Exo表面存在高糖基化的pre-miR-21κ，与糖尿病患者Exo不同κ (图3C，D）。糖尿病患者Exo上糖果RNA丰度的降低κ这可能解释了糖尿病患者常见的伤口mΦ较高表面电荷和较少的吸收。这一观察支持了我们的假说：糖RNA存在于外骨骼κ表面是有效细胞间通信的关键，尤其是角蛋白细胞-mΦ的交互作用。

表面糖RNA介导巨噬细胞对外泌体的摄取

鉴于糖RNA定位于外骨骼κ表面上，它们很可能影响受体细胞对外泌体的摄取。(64)外泌体提出了多种细胞进入方式，我们进一步探讨了糖链作为外泌体摄取潜在决定因素的作用。(64,66)以往研究表明，糖苷酶处理可以通过去除糖链改变外泌体表面动态，从而可能改变外泌体的物理化学特性，包括ζ势(67)以及直径，并以不受受体独立的方式影响捕获。相反，其他研究报告PNG酶F酶处理后外泌体物理特征无显著变化，暗示糖链可能主要驱动摄取效应。(68)然而，处理后囊泡电荷被发现减少，目前尚不清楚摄取增加是由于糖链-受体相互作用，还是与电荷和静电效应相关。进一步探讨小鼠Exo的角色κ细胞吸收中的表面糖链，我们在PNGase F处理后用ExoGlow膜标记染料对外泌体进行了荧光标记。PNG酶F处理不会影响外光膜标记，这一点通过珠流式细胞术（图S12).处理过和未处理的外泌体随后与小鼠mΦ进一步孵育，并通过活细胞共聚焦显微镜检测摄取（图4A–C 和第十三季).活细胞成像显示，PNG酶F处理外泌体的mΦ摄取受损，而未处理外泌体则较少。Z叠分析显示，标记的外泌体被小鼠mΦ内化，定位深度约为9微米，确认了它们在细胞内的存在，而非单纯的表面粘附（图4C 和第十三季).为了进一步探究外泌体表面RNA在细胞吸收中的作用，外泌体先对RNase进行处理，随后进行活细胞成像（图S14).与PNGase F处理类似，RNase A处理的外泌体也表现出细胞摄取受损（图S15).这些发现强调了糖RNA在外泌体表面作为细胞内化关键介质的关键作用。

共价糖链-RNA连接定义了外泌体表面糖RNA

一项最新研究表明，哺乳动物中有一类小RNA在超修饰碱基3-（3-氨基-3-羧丙基）尿苷（ACP）处发生N-糖基化3U），生成表面暴露的糖RNA，以维持免疫稳态。(69)这些糖RNA通过内体体通路出现，出现在质膜上，但不激活先天传感器。这些观察也支持内体起源的外泌体包含糖RNA的观点。此外，这也解释了我们之前发表的观察：当角蛋白细胞来源的外泌体摄取受损时，促炎巨噬细胞无法解决。(13,14,65)PNGase F去除N-糖链会揭露RNA主链，将这些分子转化为TLR3/7激动剂，而修饰酶DTWD2的丧失则会消除该反应。(69)因此，糖链起到结构屏障的作用，隐藏免疫刺激的ACP3U基地。我们的研究表明，与糖链近端定位到MB信号不同（图2E），利用双尼克酶质粒沉默人类角质细胞中的DTWD2（图S16）消除了糖链-MB信号，进一步暗示糖链与前miRNA之间的共价连接（图5).这些发现共同确立了RNA的N-糖基化作为一种化学编码的免疫逃避和稳态解决机制，连接了RNA化学、糖生物学和先天免疫调控。

有趣的是，另一种内核糖核酸酶MCPIP1（Zc3h12a）据报道能切割前miRNA的末端环并抵消Dicer，主要抑制mRNA新生miRNA的生物合成（图S17A).(70)MCPIP1治疗后糖RNA信号无变化，表明末端环的切割不足以解离糖RNA信号。这引出了外泌体表面糖RNA的合理假设模型，表明这两条链要么嵌入了，要么与另一种生物分子结合，防止两股链在外泌体表面解离（图S17B，C).

在这份手稿正在修订期间，bioRxiv 服务器上的预印本(71)随后发表于PubMed。(72)报告称胞外外泌体RNA经历糖修饰。这些糖RNA不仅仅与表面结合，还被包裹在外泌体中。(71)然而，所采用的亚细胞分馏方法并不能完全排除质膜来源囊泡的存在。（73−75）因此，CD9（同样存在于细胞膜）在缺乏特定内体标志物如TSG101、Rab5A或ALIX的情况下，无法确认外泌体纯度。（21,76−78）与密度梯度超离心不同，采用基于沉淀的外泌体分离方法，且无需适当尺寸验证，并不能排除其他膜起源囊泡类型（包括微囊泡、凋亡体和蛋白聚集体）的潜在污染。(79,80)尽管研究依赖GW4869和Manumycin-A抑制外泌体生物合成，但必须承认这两种抑制剂直接影响高尔基氏功能和囊泡运输，(81)引发了关于研究中观察到的糖RNA积累是否仅由外泌体抑制引起的担忧，还是也反映了细胞囊泡运输的更广泛紊乱。

与Flynn等人进行的研究一致，(7)我们对RNase A和PNGase F进行了酶治疗后点击化学反应。我们同时进行早期点击和晚点击作，观察到两种方法之间无显著差异。这一方面进一步强调了糖RNA检测方法在不同实验条件下的鲁棒性和可重复性。OL方法与MB方法的灵敏性和稳健性共同促进了外泌体表面直接糖链-RNA连接的发现。(33)该方法的多功能性预计将显著推进糖RNA生物学的理解。

结论

我们推测该标记技术将加快糖RNA结构和功能的表征。尽管取得了这些进展，糖RNA的生化和功能特性仍大多未被充分探索。开发未知序列糖RNA的成像技术至关重要，可能需要使用通用RNA识别试剂。此外，将单糖的标记和研究扩展到唾盐之外，还能为糖RNA生物学提供更深入的见解。我们预见，应用先进的成像技术来可视化糖RNA，将成为未来研究的关键发展。本研究为糖尿病Exo摄取受损的机制基础提供了关键见解κ已知会导致糖尿病患者出现未解决的炎症和伤口慢性化。