好文速递｜肿瘤相关成纤维细胞源性外泌体调控肿瘤耐药机制的研究
摘要
Abstract
肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）作为肿瘤细胞赖以生存的内环境，在肿瘤治疗和耐药中起着举足轻重的作用。其中肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast，CAF）可以重塑细胞外基质、分泌可溶性因子和释放细胞外囊泡，从而调控肿瘤生物学进程，并影响肿瘤耐药。CAF源性外泌体（CAF-derived exosome，CDE）即CAF释放的胞外囊泡，成为拓展CAF研究领域的关键一环，其可影响肿瘤发生发展进程，尤其对肿瘤放化疗耐药机制形成有重要作用。本文综述了CAF及CDE在肿瘤耐药中的作用，阐述了不同肿瘤耐药形成过程中CDE的具体调控机制，并对CDE在抑制肿瘤耐药形成中的应用进行了讨论与展望。
关键词
Key words
肿瘤相关成纤维细胞；外泌体；耐药；肿瘤细胞
肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是肿瘤细胞生存的内环境，对肿瘤治疗和耐药至关重要。除肿瘤细胞外，TME 还包含多种组分。肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast，CAF）是TME中的特异性细胞群，它们可以重塑细胞外基质、分泌可溶性因子和释放细胞外囊泡，从而调控肿瘤生物学进程，并影响肿瘤耐药。目前，相关研究多聚焦于CAF本身在肿瘤发生发展过程中的作用，这可能是导致CAF作用机制和肿瘤治疗研究存在局限性原因之一。在此背景下，CAF 源性外泌体（CAF-derived exosome，CDE）成为关键。因此，本文将探讨CAF及CDE在肿瘤耐药中的作用、具体调控机制以及在抑制肿瘤耐药形成中的应用。
01
｜CAF及CDE在TME中的作用
1.1
CAF的异质性与肿瘤耐药
自“种子-土壤”学说被提出以来，TME及其重要组分CAF在肿瘤进展和治疗耐药中的作用机制得到了广泛研究。众多研究发现CAF可来源于正常成纤维细胞、周细胞、脂肪细胞以及上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和内皮间质转化等途[1-2]，来源的差异使CAF的功能和表型具有多样性，这种异质性也为研究CAF与肿瘤的串扰机制带来了挑战。随着单细胞RNA测序技术的发展，通过一系列生物标志物将CAF进行分类，有助于对CAF在TME中的耐药机制进行深入研究：炎症相关型CAF（inflammatory cancer-associated fibroblasts，iCAF）具有激活补体、产生趋化因子、引起炎症反应的作用[3]；肌成纤维型CAF（myofibroblastic cancer-associated fibroblasts，myCAF）的主要功能是促进伤口愈合、胶原形成、重塑ECM[4]；抗原呈递型CAF（antigen-presenting cancer-associated fibroblasts，apCAF）具有免疫调节作用，可以特异性激活CD4+T细胞[5]；代谢相关型CAF（metabolic cancer-associated fibroblasts，meCAF）以代谢重编程为主要功能[6]；泛癌CAF（pan cancer cancer-associated fibroblasts，pan-CAF）具有调节细胞周期、产生Ⅰ型干扰素（type Ⅰ interferon，IFN-Ⅰ）的作用[7]，CAF（vascular-related cancer-associated fibroblasts，vaCAF）的功能是促进血管生成与发育[8]；生长型CAF（developmental cancer-associated fibroblasts，dCAF）来源于恶性肿瘤细胞附近，与促进癌症干细胞特性相关的[8-9]；还有一类为Meflin+的肿瘤抑制型CAF（cancer-restraining cancer-associated fibroblasts，rCAF）主要功能是通过软化肿瘤间质抑制癌症细胞[10]。不同亚型的CAF在促治疗耐药过程中发挥的作用也不尽相同。例如在黑色素瘤中，表达iCAF亚型会降低免疫检查点抑制剂的治疗敏感性。此外，有研究化疗耐药的文献指出，分化myCAF诱导重塑ECM，形成致密物理屏障让药物难以渗入[11]，硬化的ECM挤压外周血管减少血流，从而降低药物输送的效率，进一步促进肿瘤耐药。随着精准医疗这一概念的应运而生，将表型和功能高度异质性的CAF进行生物学特性亚分类，有助于临床医师根据相同病理类型的患者因不同亚型的CAF产生对肿瘤治疗药物反应的不同进行精准分类和靶向精准治疗。在作用方式上，CAF介导的肿瘤耐药除自身直接作用于肿瘤细胞或TME外，还能通过分泌外泌体传递特殊分子影响肿瘤放化疗的疗效[12]。因此，深入探讨总结CDE在肿瘤发生发展中和治疗耐药中的作用，对指导肿瘤的临床治疗策略有着意义深远。
1.2
CDE在TME中的促癌作用
外泌体是大小30~150 nm的特殊膜性囊泡，通过携带蛋白质、RNA和代谢产物等从供体细胞转移到受体细胞产生生物学效应[13]。与正常细胞源性外泌体相同，CDE的生物合成经历了质膜内陷形成内吞小泡、内涵体的胞质膜向内出芽形成多囊体、多囊体与质膜融合后向细胞外释放3个阶段[14]。治疗耐药向来是提高癌症治疗疗效和改善患者预后的主要障碍。而在各种耐药肿瘤的微环境中，CAFs和CDE的异位改变普遍存在，这提示CDE可能在癌症耐药中发挥了作用。进一步研究发现，与正常成纤维细胞分泌的外泌体相比，miR-181d-5p[15]、miR-500a-5p[16]等在耐药乳腺癌CDE内明显上调；一些富集circHIF1A的CDE通过降低肿瘤细胞miR-580-5p水平，间接促进CD44的表达，增强了TME中癌症干细胞对放化疗的耐药敏感性[17]。可见，装载功能性非编码RNA的CDE通过复杂机制和信号通路在癌症耐药中作用明显。随着理解的不断深化，研究人员发现，CDE也可以通过其装载的TGF-β[18]、SHH[19]及MFAP5[20]等蛋白质影响肿瘤耐药。CAF与CDE均为TME中的重要组分。而CAF的异质性，使得CAF在功能和表型上具有复杂性，这在一定程度上为研究CAF对肿瘤进展的影响带来了挑战。相较而言，CDE作为CAF分泌的胞外囊泡，其结构和组成上更为简单。综上可知，CDE在促进肿瘤耐药中也发挥了重要作用。因此，CDE或可为CAF相关研究开拓新的领域，侧面加深对肿瘤耐药过程中CAF作用的理解。CDE相对简单的结构及组分，也可成为日后更深一步探究CAF异质性的跳板，更可能是将CAF相关研究成果向临床转化的关键锚点。
02
｜CDE在不同肿瘤耐药中的作用机制
2.1
CDE介导结直肠癌耐药
在所有肿瘤中，结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率排名第三，病死率排名第二，治疗手段主要是根治性手术或联合放化疗[21]。然而，对化疗药物的耐药是导致转移性CRC患者生存率低的主要原因。研究发现，用富集miR-92a-3p的CDE处理小鼠直肠癌模型后，转移性肺单核结节增多以及癌细胞的存活率和集落形成能力增强，同时对临床药物5-氟尿嘧/奥沙利铂产生耐药性[22]。其中，miR-92a-3p对FBXW7和MOAP1表达的抑制，是诱使直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶耐药的关键。除了化疗耐药外，CDE也可诱导结直肠癌的放疗耐药。Chen XJ等[23]发现，CDE中的miR-93-5p可靶向下调CRC细胞中FOXA1的表达，提高CRC细胞的干性和集落形成能力，最终降低CRC细胞对放疗的敏感性。Chen XJ等[24]的后续研究表明，CDE装载的miR-590-3p上调CRC细胞中PI3K和AKT的磷酸化，从而降低Cleaved-caspase3和PARP的表达，最终起到抑制肿瘤细胞凋亡和防止DNA损伤的作用。由此可见，CDE还能通过调节肿瘤细胞的活力，影响CRC细胞对放疗的耐药性。术后肿瘤细胞转移及放化疗耐药是导致结直肠癌患者预后不良的主因，上述研究则揭露了CDE在促进结直肠癌转移和耐药的可能分子机制。结合结直肠癌这一治疗特性，深入探索CDE影响结直肠癌转移和耐药的具体机制，可为针对性地研发相关外泌体抑制剂作铺垫，从而改善结直肠癌患者预后。
2.2
CDE介导肺癌耐药
肺癌一直以高发病率、高转移和高死亡率为主要特点[25]，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常见的亚型，全球每年约有25万人被诊断出患有SCLC，其中约有20万人死于该疾病[26]。首选的治疗方案是手术切除，而后联合铂类化疗。在针对NSCLC衍生的CAF对顺铂治疗耐药性产生研究中发现，CAF条件培养基明显提高了顺铂治疗后NSCLC的生存率，其机制与CAF在PUM2介导下将miR-130a包装成外泌体，再被非小细胞肺癌细胞吸收后直接靶向Bak1，抑制NSCLC凋亡并促进顺铂治疗后的耐药性有关[27]。而在小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）中，Sun YL等[28]从CAF条件培养基中分离的外泌体开始研究，发现CDE中MEG3高表达，而MEG3作为吸引miR-15a-5p的海绵，下调了CCNE1的表达，从而诱导顺铂耐药性。放射治疗也是治疗肺癌的有效方式，但肺癌患者长期放疗后，肺癌细胞会产生抗辐射效应。Yao F等[29]发现，CDE通过miR-196a-5p下调了NFKBIA的表达，进而增强了肺癌细胞的放射性疗敏感性降低，这为放疗耐药的肺癌患者提供了一个新的潜在治疗靶点。显然，不同治疗阶段、不同分型的肺癌中，CDE在肺癌细胞的生物学进程和耐药方面发挥的作用不尽相同，阐明CDE在其中介导的具体分子机制，将有助于优化肺癌的临床诊疗策略。
2.3
CDE介导乳腺癌耐药
作为女性最常见的癌症，乳腺癌的治疗耐药一直是影响患者预后的主要原因。他莫昔芬是雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性乳腺癌患者最常用的治疗药物，但许多癌症患者最终还是因为他莫昔芬耐药而预后不良。他莫昔芬耐药可能由多种机制引起，其中，通过透射电镜和纳米粒子跟踪分析发现ER+可能有助于肿瘤细胞吸收CDE分子，促进肿瘤耐药[30]。CD63+的CDE在介导乳腺癌对他莫昔芬的耐药中起重要作用，其携带的miR-22可靶向下调ESR1和PTEN的表达，最终使乳腺癌细胞向他莫昔芬耐药表型转化[31]。除了靶向治疗耐药外，最近的研究发现，CD63+CDE中富集的miR-20可以直接靶向RB1 mRNA 3'UTR，抑制RB1的转录，这降低乳腺癌细胞对CDK4/6抑制剂的敏感性，大大限制了晚期ER阳性乳腺癌患者的疗效[32]。长期接触不同抗肿瘤药物所导致的特定耐药型 CAF，给中晚期乳腺癌患者的治疗带来了巨大的挑战。然而，这既是挑战也是机遇，通过研究外泌体在 CAF 和肿瘤细胞之间沟通产生的物质及靶向的特殊信号通路，有利于在临床用药过程中尽早发现耐药情况的产生，从而针对性改变治疗策略，提高乳腺癌患者的生存率。
2.4
CDE介导其他肿瘤耐药
作为一种高度恶性的消化系统肿瘤，大多数胰腺癌患者一经确诊便已处于晚期。胰腺癌手术切除后的复发率极高，因此，手术联合化疗是PDCA患者的主要治疗方案，而化疗耐药则是PDCA患者5年生存率低下的主要原因。Richards等将耐药性胰腺癌产生的CAF进行测序，结果发现接触吉西他滨的CAF释放的外泌体明显增加。这些外泌体上调了受体上皮细胞中的snail蛋白的表达，促进了肿瘤细胞增殖和耐药[33]，而阻断CDE的释放则增强了胰腺癌小鼠模型对吉西他滨的敏感性。此外，CDE装载的miRNA也可降低吉西他滨对胰腺癌细胞的化学毒性：miR-106b靶向激活胰腺癌细胞的TP53INP1，促进胰腺癌细胞的化疗耐药[34]。
在膀胱癌中，CAF中的miR-148-3p可借助CDE转移到膀胱癌细胞中，其通过提高PTEN的表达促进了肿瘤增殖、EMT和转移，并使肿瘤细胞对紫杉醇和阿霉素的化疗敏感性降低[35]。临床癌症免疫治疗的目标是使患者免疫系统对恶性肿瘤产生被动或主动免疫。而Feng R等[36]研究发现，CDE可以通过上调PD-L1/PD-1介导膀胱癌的免疫逃逸。体内实验同步证实，小鼠CD8+T细胞分泌的干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）明显减少，这暗示CDE可能在诱导膀胱癌的免疫治疗耐药性中发挥作用。
早期胃癌患者通过手术可以得到根治，而进展期胃癌患者则需要采用以手术为主，基于顺铂等多药联合的化疗、放疗和靶向治疗为辅的综合治疗，但该类患者5年生存率仍然较差[37]。研究发现，晚期胃癌TME中的CDE-miR-522可通过激活USP7/hnRNP1途径促进胃癌细胞对顺铂和紫杉醇的耐药[38]。此外，CDE-miR-522还能直接靶向ALOX15，抑制胃癌细胞中脂质活性氧的产生，从而抑制铁死亡，促进化疗耐药[38]。有效的肿瘤生物标志物是表征癌症状态和监测癌症进展的关键，液体活检作为收集生物液体标本的新方法，为早期癌症诊断、预后预测和治疗效果评估提供了更多的可能性，开展早期胃癌及耐药早期的CDE肿瘤标志物开发将有助于根治胃癌。
综上所述，CAF分泌的外泌体会导致癌细胞生长、癌症转移以及肿瘤放化疗耐药。由于外泌体在细胞——细胞通信中发挥作用，它们可以将miRNA、LncRNA或蛋白质转移到受体细胞。随着外泌体示踪、提取技术的不断发展，现有的实验也表明含有调控肿瘤细胞生长、介导肿瘤微环境耐药的外泌体是从CAF中分泌的，外泌体内容物被多种肿瘤的癌细胞吸收后，在调节癌症进展和放化疗敏感性方面发挥着至关重要的作用。因此，针对特定靶点研发CDE分泌抑制剂，或将CDE内容物受体阻断剂作为新的治疗靶点，与目前临床治疗方案结合使用，以对抗放化疗耐药性，有望提高治疗效率、延长放化疗药物敏感期。
03
｜CDE在抗肿瘤耐药临床应用价值
CDE可携带RNA、蛋白质和DNA等，这一特性在精确医学领域具有重要意义。CDE携带多种分子的能力及其与CAF和癌细胞间的通信功能相结合，构成了CDE临床癌症治疗应用的基础。其中，针对CDE的内容物及其分泌方式，研制出的药物可以通过特异性减少CDE的内容物或阻断其传递，以降低肿瘤细胞耐药性。例如，相关研究表明GW4869作为减少外泌体释放和抑制外泌体形成的常用药物，在由吉西他滨治疗后产生耐药的胰腺癌治疗中，发挥出直接且高效的作用[33]。此外，CDE作为传递载体，在蛋白治疗、基因治疗、化疗药物中，可通过释放相应内容物改变靶细胞的生物学行为[39]；CDE作为外泌体，同样可以保护正常细胞分子免受CAF等的影响，从而抑制TME形成，这使其有望成为抗癌疫苗。体内CDE编辑过后治疗效果更加明显，例如将蛋白质拮抗剂导入CDE中进行免疫调节，国外研究发现携带SIRPα变体的外泌体可以拮抗CD47，从而促进巨噬细胞的吞噬作用[40]。此外，以CD47免疫检查点阻断疗法的研究为基石，Gao XJ等[41]开发了一种CD47过表达外泌体，将此外泌体与负载药物的脂质体融合形成混合纳米囊泡，可起到阻断CD47信号、促进巨噬细胞介导的肿瘤吞噬作用。
外泌体呈现出生物相容性、低免疫原性及固有组织靶向性，这为药物治疗开拓了新的方向。近年来，CDE净化技术、药物装载技术和定向输送的生物工程等技术明显提高了各个医疗领域的治疗效果。对于小分子化疗药物，使用共培育法将药物添加到培养基中，使它们能够穿过脂质双层，进入细胞，然后通过内源性生物生成机制进入外泌体中[42]。这一方法保证了外泌体结构完整性的优势，但装载效率受到药物特性和共孵育条件的影响。因此，为了高效地将疏水和亲脂药物装载到外泌体中，超声与共培育的联合促载也是一种新的有效途径。例如，将含有甲氨蝶呤的外泌体用于晚期肺癌患者，可刺激CD4+ T细胞和CD8+T细胞分别释放IL-2和IFN-γ，能有效抑制肺癌免疫抑制微环境的形成[43]。电穿孔是将核酸和靶向药物纳入外泌体的最常用技术[44]。将5-氟尿嘧啶和miR-21抑制剂通过电穿孔共载到CDE中，并靶向结肠癌细胞输送，可以提高药物疗效并减轻肿瘤耐药[45]。尽管电穿孔在运输体积相对较大的RNA和化疗药物上具有优势，但电穿孔可能会诱发外泌体聚集，或使外泌体结构不稳定，这可能会降低输送系统的有效性。除了药物装载技术的精进，如何将改装外泌体定向输送到肿瘤器官也是临床应用外泌体的主要课题。tLyp-1即可作为一种穿透肿瘤血管和基质并可以深入肿瘤实质的肿瘤定位肽[46]。通过用tLyp-1-Lamp2b融合质粒转染HEK293T细胞制备成tLyp-1外泌体，随后通过电穿孔继续装载SN38和MEF2D-siRNA。结果显示，肿瘤细胞对tLyp-1/siMEF2D/SN38外泌体的吸收作用更强，这表明临床治疗中，或可通过tLyp-1将该装外泌体靶向输送到肿瘤细胞。
从提高治疗效果和减少毒性，到实现新的治疗模式和提高患者的依从性，CDE在癌症临床治疗中作为蛋白或药物载具很有应用前景，然而，要取得更好的临床效果，仍有许多诸如高效安全传递方式、非癌性外泌体的非特异性抑制以及CDE形成和释放代偿途径的触发等障碍需要克服。当然，除了治疗性外，前期临床试验中，外泌体初级化合物的可重复性和有效性的评估，也是亟须解决的问题。
04
｜小结与展望
CAF 是 TME 中主要的基质细胞，影响癌症进展，其异质性使肿瘤发展更复杂，也是目前肿瘤治疗难以全面有效的原因之一。迄今为止，大多数研究主要关注CAF在TME中与肿瘤细胞的直接相互作用，但其分泌的外泌体介导的串扰机制也对肿瘤治疗造成一定阻碍。也正是因为CAF的异质性导致CDE的研究存在局限性，因此本文就不同肿瘤主要治疗手段的差异，及其特征性耐药机制的不同进行综述。CDE可以作为运输工具，为癌细胞提供“燃料”，促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并调节肿瘤基因表达，重塑ECM使其形成物理屏障等，最终导致癌症耐药。此外，因CAF具有动态转化的双向调节的特性，所以在深入研究CDE促肿瘤耐药的机制的同时，或可将促癌性CAF及其衍生外泌体重新编程为正常成纤维细胞或抑癌CDE的机制研究，作为一种肿瘤治疗策略的创新途径。
利益冲突 所有作者声明不存在利益冲突作者
贡献声明 武家帆：框架设计、文献撰写；刘源：主导综述主题、文献修订；黄文文：文献修订；李潇：文献检索；王欣宇：文献分析；李汝红：监督研究全流程、把控综述研究方向
参考文献
