一文读懂外泌体

外泌体鉴定

      由于分离纯化手段的限制，难以获得纯度高且单一性强的外泌体，因此后续需要通过多种实验来评估外泌体样品的纯度和完整性。

      据国际细胞外囊泡学会(ISEV)在2014年的提议，外泌体鉴定3个标志：透射电镜(transmission electron microscope，TEM)、粒径(Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)、蛋白标志物(Western Blot，WB)。

电镜成像：透射电子显微镜观察法(TEM)是从形态和大小上对外泌体进行鉴定通过负染的方法，在高倍放大下直接观察单个外泌体的形态结构和大小。但电镜会有背景的干扰，且无法区分外泌体和与其形态相近的粒子。

粒径检测：通过光学原理感知粒子的存在，可以从整体上对外泌体数量和直径的群体特征进行检测，具有准确、快速、重复性好等优点，是对现有外泌体鉴定方法的良好补充。但不能确认外泌体的真实存在和外泌体的完整性，不适用于复杂样品的检测。

Western Blot检测：采用抗原抗体特异性相结合的原理，对外泌体标志蛋白进行检测，从蛋白质层面对外泌体进行鉴定，能证实外泌体成分的存在。常用的外泌体标志蛋白包括CD63、TSG101及Alix等。

1、亲脂性染料：PKH-67(green)/PKH-26(red)

       染料可以稳定地与细胞膜脂质区结合并发出荧光，主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究以及体内外的细胞失踪研究。PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。相比于PKH-67，PKH-26具有更长的半衰期，标记在兔红细胞上的PKH26半衰期长达100天以上。特别适用于体外增殖研究以及长期的体内细胞跟踪研究。

2、亲脂性羰花青染料(carbocyanine dyes)：Dil/DiD/Di0/DiR

      Dil，DiO，DiD，DiR是亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。这些染料在进入细胞膜之前荧光非常弱，当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强。且具有消光系数高、极性依赖性、激发态寿命短等特点。进入细胞膜后，可在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。

3、渗透型的化合物标记法：CFSE/CFDA/Calcein-AM

①羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)：

       CFSE可被动扩散进入细胞，这种试剂没有颜色和荧光，直至细胞内的酯酶去除其醋酸盐基团，产生能发出明亮荧光的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。琥珀酰亚胺酯与细胞内氨基反应，形成稳定且能用醛固定剂固定的荧光偶联物。

②钙黄绿素(Calcein-AM)：

       在Calcein的基础上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM(本身不发荧光)被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。

      此外还有使用放射性标记物，量子点微囊泡标记法来标记外泌体已达到体内追踪外泌体成像。

      1、外泌体作为药物载体，实现靶向给药。外泌体具有负载“货物“并将其传递给靶细胞的能力，可用于细胞间通讯，尤其是远距离通讯。以外泌体作为药物转运载体，具有免疫源性低、运输效率高、稳定性好和靶向性强以及能跨越血脑屏障等独特优势。外泌体也适合递送各种化学物质、蛋白质、核酸等。Buller B等将负载 miR-146的外泌体注射至患有角质细胞瘤小鼠的肿瘤部位，发现miR-NAS有效的抑制了肿瘤的生长。

      2、疾病诊断的分子标志物。不同疾病的不同类型细胞都能分泌含有不同miRNAS和RNAS的外泌体，使得从病人的体液中分离外泌体作为疾病诊断成为可能，尤其在肿瘤诊断中。除此之外，外泌体还可以应用于非肿瘤疾病的诊断。Welker   MW等研究发现血清外泌体CD81可能是慢性丙型肝炎诊断的潜在蛋白标志物。

      3、促进组织修复和再生。近年的研究发现，干细胞来源外泌体是干细胞旁分泌活动的一种重要方式，可介导其促进组织再生。Chen等发现，ADSCs-exo 的联合治疗可减少大鼠急性缺血性卒中的梗死面积，促进神经功能恢复。ADSCs-exo可以避免干细胞治疗的免疫排斥、伦理问题等缺点，且具有高稳定性、易于储存、无需增殖、便于定量使用等优势，与单一的细胞因子比较，具有较高的安全性和更大的组织再生潜能。