冉冉升起的生物药新星“外泌体”

 什么是外泌体？

 

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是一种由细胞释放到细胞外基质的膜性小囊泡，其粒径分布范围为30nm-1μm，它们通过膜上的蛋白质、脂质等信号分子，以及膜内包裹的内容物（神经递质、酶、激素和核酸等）在细胞之间的通讯和机体调控中发挥着至关重要的作用。
根据分泌途径的不同，EVs主要分为外泌体（Exosomes, 30-150nm）和微囊泡(Microvesicles, 100~1000nm)，另外还有一类凋亡小体(Apoptotic Bodies, 50-1000nm)。外泌体经由细胞内多泡体(Multivesicular Body, MVB)与细胞膜融合而释放，而微囊泡则是通过细胞膜包裹信号分子直接释放到细胞外。

外泌体研究史&里程碑
 

2013年诺贝尔生理学或医学奖授予James E. Rothman、Randy W. Schekman和Thomas C. Südhof，以表彰他们在细胞内主要运输系统的囊泡转运调控机制方面的重要发现（for their discoveries of machinery regulating vesicle traffic）——

“这改变了我们对真核细胞如何组织分子在各种细胞内目的地之间，以及到细胞外的囊泡打包和运输的认识。”

外泌体有什么用？

 

外泌体功能：可以将外源物质（如蛋白，mRNA，miRNA, DNA，脂质）转移至受体细胞，可靶向递送，并且穿过血脑屏障，具备低免疫原性。

潜在适应症领域：肿瘤治疗；组织修复（涉及多方面，如治疗性医美、皮肤疾病、器官损伤修复）；基因治疗、罕见病等。

 

生产工艺

 

01上游-制备工艺

 

外泌体从培养细胞的条件培养基中获得。条件培养基应避免外源性外泌体的干扰，不包含相应添加物，例如胎牛血清（FBS或FCS）、血小板裂解物、垂体提取物、胆汁盐等其他复合产品。否则应建立方法，以评估培养基中干扰物所产生的影响。
根据产品特点，目前外泌体产品可以有3种不同的来源和生产方式。

01

天然外泌体

iPSC 来源的外泌体可以代替MSC, DC的传统细胞疗法。

02

工程化外泌体（前载）

由细胞生产外泌体，然后加载治疗分子（RNA，DNA，蛋白，脂质或者CRISPR工具），通过表面标记物实现靶向。
生产细胞：HEK293 细胞或者间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)

03

工程化外泌体（后载）

细胞的DNA经过基因改造，直接表达外泌体内的治疗分子。
生产细胞：HEK293 细胞或者间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)

 

02下游-纯化工艺

 

采用超速离心、切向流过滤、层析、超滤等方法实现外泌体的提取分离。
•料液澄清：0.22μm深层过滤，去除杂质，细胞碎片和胞外囊泡；
•超速离心：富集浓缩外泌体，进一步去除杂质；
•切向流过滤：TFF中空纤维，去除杂质蛋白和游离核酸，核酸酶酶解；
•精纯：阴/阳离子交换层析，除杂质蛋白和核酸
•超滤：使用β-丙内酯先灭活病毒，再用TFF和制剂置换配方
•终产品：进行灌装或制成冻干粉，便于运输和储存。

 

质量控制

 

类别	检测项目	检测方法
常规理化	外观	ChP
	pH	ChP
	渗透压	ChP
	不溶性微粒	ChP
外泌体鉴别	形态结构	透射电镜
		冷冻电镜
	EVs阳性标志物分析	Westen blot/纳米流式
	胶体稳定性	Zeta电位
含量	总蛋白、脂质、RNA	BCA、脂质试剂盒、CE
	颗粒数	NTA/纳米流式/DLS
	粒径	NTA/纳米流式/DLS
	组学分析	LC-MSRNA seq
纯度	HPLC-SEC	HPLC-SEC法
	有膜颗粒占比	纳米流式
	颗粒蛋白比	纳米流式/BCA蛋白含量比
	颗粒RNA比	纳米流式/RNA含量比
	颗粒脂质比	纳米流式/脂质含量比
安全性	无菌	培养法
	支原体	培养法/qPCR
	内毒素	凝胶限度法
	HCD	qPCR/ddPCR
	HCD片段分布	qPCR/CE
	HCP	ELISA
	BSA残留	ELISA
	核酸酶残留	ELISA
生物活性	目的蛋白表达	ELISA/纳米流式
	基于细胞的活性	细胞培养法

注：由于目前EVs行业暂未发布较权威且适用广泛的法规指南，质量控制相关接受标准未列出。可参考文章末尾文献，并结合产品特性制定标准。

 
总结与展望

 

EVs在生物成药领域蕴藏着巨大的潜力。与传统的基因与细胞治疗相比，EVs药物具有免疫原性更低、粒径更小、透过生物屏障（血脑屏障）的能力更强等天然特性。EVs还能够作为携带药物、核酸或者蛋白质的递送载体，用于治疗癌症、神经系统疾病和炎症性疾病。
但目前，EVs产业化发展尚处于早期阶段。拥有巨大发展潜能的同时，也面临着重大的挑战。从CMC角度，如何进行成熟规模化的生产，如何建立工艺开发、生产、质量控制和临床的标准，都是行业亟待解决的问题。规模化生产首先需要解决上游供体细胞分泌效率，大规模细胞培养要考虑的技术瓶颈是，如何在保证EVs产物质量的同时，降低生产成本，提高产量的稳定性；下游纯化对于后续产业化扩大临床级应用的生产规模至关重要，需要确保纯化的效率和回收率，以及质量的可控性；而质量控制环节，需要开发完善稳健的分析方法，对生产全过程，产品全周期进行质量控制管理。另外，制定相应完善的评审和监管体系，亦是产业化发展的重要基石。
因此推动学术界、产业界与监管机构的密切交流和合作，构建协同创新的生态系统，共同推进EVs的临床转化和商业化进程，任重而道远。

 

一些参考文献

 

[1] Tenchov R, Sasso JM, Wang X, Liaw WS, Chen CA, Zhou QA. Exosomes ─Nature's Lipid Nanoparticles, a Rising Star in Drug Delivery and Diagnostics. ACS Nano. 2022 Nov 22;16(11):17802-17846. doi: 10.1021/acsnano.2c08774.
[2] T/FDSA 0049-2024, 人源间充质干细胞外泌体制备与检验规范[S].中国食品药品企业质量安全促进会, 2024.02.03.
[3] Vo N, Tran C, Tran NHB, Nguyen NT, Nguyen T, Ho DTK, Nguyen DDN, Pham T, Nguyen TA, Phan HTN, Nguyen HN, Tu LN. A novel multi-stage enrichment workflow and comprehensive characterization for HEK293F-derived extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2024 May;13(5):e12454. doi: 10.1002/jev2.12454.