外泌体治疗 | 3D-MSC外泌体水凝胶促进角膜伤口愈合

最近山东第一医科大学青岛眼科医院、眼科研究所等科学家团队在Journal of Controlled Release期刊上发表的一篇关于 “3D mesenchymal stem cell exosome-functionalized hydrogels for corneal wound healing.” 文章（3D-MSC外泌体水凝胶促进角膜伤口愈合），阐述了间充质细胞 (MSC) 外泌体具有维持免疫稳态和促进组织再生的潜力，且三维 (3D) 培养的MSC外泌体疗效更强。

证明了与2D培养的MSC外泌体（2D-Exos）水凝胶相比，3D培养的MSC外泌体(3D-Exos)外水凝胶具有更好的角膜形态和功能恢复，如减轻炎症、促进角膜上皮和角膜缘修复以及减少基质中的疤痕形成。
阐明了MSC外泌体发挥角膜伤口修复的分子机制，3D-Exos通过miR-150-5p靶向PDCD4，促进角膜衍生细胞的增殖并减少炎症因子的释放。
开发的3D-Exo水凝胶缓释系统可以作为各种角膜疾病的无细胞治疗方案。

01 
背景
角膜是眼睛最外层的透明部分，保护眼内组织，在视觉系统中起着至关重要的作用。
角膜疾病和损伤，如角膜溃疡 (如Terrien角膜边缘性变性和蚕食性角膜溃疡) 和化学损伤/热烧伤，不仅会导致角膜基质结疤和变薄 (CSST) ，还会导致部分角膜缘间充质细胞缺乏 (LSCD) ，最终导致失明。
角膜移植仍然是修复受损角膜和恢复视力的最常见的治疗方案。
然而，伴有部分LSCD的CSST是一种复杂的角膜致盲疾病，由于角膜缘间充质细胞 (LSCs) 数量减少，导致持续的上皮缺损和眼表炎症，常规角膜移植术的疗效非常差。
考虑到这一问题的严重性，角膜移植与角膜缘间充质细胞移植 (LSCT) 同时进行或在LSCT后再进行角膜移植进行是一种非常先进的临床方法，用于再生角膜基质和再生LSC，以综合治疗受损的角膜。
然而，移植需要供体组织、先进的外科手术和专业设备，更重要的是，它具有很高的排异风险，并需要长期全身免疫抑制。
间充质干细胞 (MSCs) 是再生医学的“明星”，在临床前和临床研究中显示出巨大的前景。但MSC移植面临着巨大的障碍，如免疫排斥和非定向细胞分化。
不断积累的证据表明，间充质干细胞的疗效主要是其外泌体的旁分泌作用介导的。
外泌体是纳米级的囊泡，可以有效地将多种生物分子 (蛋白质、mRNA、miRNA、酶和脂质) 传递到靶细胞中，进行细胞间通讯和信号转导。
与活的MSCs相比，外泌体 (Exos) 表现出较低的免疫原性和缺乏致瘤性，同时保留了干细胞的免疫调节和组织修复和再生特性。
同时需要相关论文表明MSC-Exos可诱导免疫调节和角膜再生。例如，脂肪间充质细胞外泌体 (ADSC) 功能化微针，在抑制免疫炎症和促进角膜伤口愈合方面表现出优势[2]。一种诱导多能干细胞 (iPSC) 衍生的MSC-Exo负载的温敏型水凝胶，促进角膜上皮的恢复和减少基质瘢痕的形成 [3]。此外，MSC-Exos可通过抑制炎症和加速上皮再生，显著减轻移植物抗宿主病(GVHD)相关的干眼症 [4]。
此外，当角膜损伤涉及基质层时，有必要应用生物相容的角膜移植物，该角膜移植物不仅能促进角膜基质再生，还能支持外泌体缓慢释放，从而提高整体治疗效果。
水凝胶被广泛用作角膜再生的支架，因为它们能够填充不规则的缺损、细胞相容性、可调的机械行为和降解特性。水凝胶可以作为持续释放外泌体的载体，保持外泌体的生物活性并优化治疗效果，而无需重复给药。
CSST，corneal stroma scarring and thinning，角膜基质结疤和变薄
LSCD，limbal stem cell deficiency，角膜缘间充质细胞缺乏
LSCs，limbal stem cells，角膜缘间充质细胞
LSCT，limbal stem cell transplantation，角膜缘间充质细胞移植

 

02 
研究数据
MSCs-Exos通过抑制炎症和减少基质瘢痕形成，在促进角膜伤口愈合方面表现出明显的潜力。
然而，受损角膜的全面修复不仅需要角膜组织结构的恢复，还需要LSC的重新繁殖以恢复角膜稳态。很少有研究报道MSC-Exos在LSCs中的作用，作者推测2D培养的MSC可能限制了Exos的功能。收集治疗性外泌体的传统方法主要基于2D单层细胞培养系统，该系统不能准确模拟MSC小生境的生理微环境，这严重限制了外泌体的大规模生产和治疗效果。
研究表明，3D培养作为一种预处理策略，可以保持间充质细胞的干性，促进间充质细胞外泌体分泌并增强治疗效果[5–7]。
与2D-Exos相比，3D-Exos具有增强的抗炎、抗凋亡和伤口愈合特性，显著提高了对白癜风、糖尿病伤口和脊髓损伤等疾病的治疗效果[5–7]。因此，3D-Exos在治疗角膜损伤方面可能具有广泛的潜在应用。3D-Exos是否是比2D-Exos更有效的治疗效果以及它们在体内的作用机制还没有被研究。 
3D-Exos功能性GelMA水凝胶发挥角膜伤口愈合的机制

 

 (A) 3D-Exos功能性GelMA水凝胶的制备。(B) 兔角膜基质缺损部分LSCD模型的建立及3D-Exos水凝胶的多种功能。(C) 显示3D-Exos通过miR-150-5p / PDCD4信号通路发挥的角膜伤口愈合作用的示意图。  limbal stem cells (LSCs)，角膜缘间充质细胞；limbal stem cell deficiency (LSCD)，角膜基质缺损

3D-Exos可以维持角膜细胞表型
在正常情况下，角膜细胞是静态的，LSC负责维持角膜上皮平衡，以防止ECM的过度分泌，从而确保角膜上皮和基质的动态平衡，促进角膜透明。然而，这种正常的生理平衡可以被对称或不对称分裂的LSC破坏；此外，角膜细胞在对各种环境刺激的反应中转化为成肌纤维细胞。因此需要评估2D-Exos和3D-Exos对人类原代LSC (CK3、CK12、P63和PAX6) 和HCSCs (Keratocan (KERA)、Lumican (LUM)、Decorin (DCN)和α-SMA) 相关蛋白和基因表达的影响。
免疫荧光显示间充质细胞标记P63和PAX6阳性的LSC数量在3D-Exos组中明显多于2D-Exos组和对照组，而分化标记CK3和CK12阳性的LSC的数量较低。此外，3D-Exos显著提高了HCSC功能相关蛋白的表达水平，包括维持基质透明性的KERA、LUM和DCN角膜特异性蛋白聚糖，但降低了成肌纤维细胞相关标志物α-SMA的表达。类似地，通过RT-qPCR测量CK3、CK12、P63、PAX6、KERA、LUM、DCN和α-SAM表达与免疫荧光染色结果相同。
这些结果证实了3D-Exos可以维持LSCs的干细胞性，同时抑制它们分化为终末成熟的角膜上皮细胞。此外，3D-Exos可以维持角膜细胞表型，减少疤痕形成并促进愈合。
limbal stem cells (LSCs)，角膜缘干细胞 ; human corneal epithelial cells (HCECs) ，人角膜上皮细胞; human corneal stromal cells (HCSCs) ，人角膜基质细胞 
Keratocan(KERA)，角膜聚糖：是一种主要存在于角膜中的糖蛋白，对维持角膜的透明度和正确的角膜基质结构至关重要。
Lumican(LUM)，发光聚糖：是一种糖蛋白，存在于包括角膜在内的多种组织中，参与胶原纤维的组织，并在组织修复和炎症中发挥作用。
Decorin(DCN)，核心蛋白聚糖：是一种糖蛋白，广泛存在于结缔组织中，通过与胶原蛋白结合来调节胶原纤维的组装，并影响生长因子活性。
α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白：是一种肌动蛋白亚型，主要存在于平滑肌细胞中，也用作成肌纤维细胞的标志物，成肌纤维细胞是参与组织修复和纤维化的转化细胞。
Cytokeratin 3（CK3），细胞角蛋白3：是一种 III 型细胞角蛋白或中间丝蛋白，与细胞角蛋白 12 形成异二聚体，几乎仅在角膜上皮中表达。CK3 和 CK12 可以一起作为角膜分化的标志物。
Cytokeratin 12（CK12），细胞角蛋白 12：是一种 III 型细胞角蛋白，与细胞角蛋白 3 形成异二聚体，是角膜上皮细胞的特异性标志物。CK12 对于维持角膜上皮细胞的结构完整性和透明度至关重要。
Tumor protein P63（P63），肿瘤蛋白 P63，是一种转录因子，属于 p53 基因家族，在许多生物过程中起着重要作用，包括细胞分化、间充质细胞维持和肿瘤发生。p63对于基底上皮细胞和干细胞的维持至关重要。
Paired box gene 6 (PAX6)，配对盒基因 6：是一种转录因子，在眼睛、大脑和脊髓的发育中起着重要作用。它参与角膜、晶状体、视网膜和中枢神经系统的形成。PAX6 的突变会导致一系列发育缺陷，包括无虹膜症（虹膜缺失）、无眼症（眼睛缺失）和神经系统疾病。

 

3D-Exos对细胞迁移和表型调控的影响。(A，B) CK3, CK12, P63, PAX6, KERA, LUM, DCN 和α-SMA的免疫荧光图像，以及(C-J) CK3, CK12, P63, PAX6, KERA, LUM, DCN 和α-SMA表达的定量分析。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.  limbal stem cells (LSCs)，角膜缘干细胞 ; human corneal epithelial cells (HCECs) ，人角膜上皮细胞; human corneal stromal cells (HCSCs) ，人角膜基质细胞 

3D-Exo水凝胶免疫调节和体外抗炎作用
过度活化的HCECs和HCSCs释放的炎性因子通常会阻碍伤口愈合，导致ECM降解甚至形成慢性伤口。因此，调节早期炎症反应可能有助于维持角膜损伤后局部微环境的稳态，这不仅有利于角膜上皮愈合，也有利于减少疤痕。
为了模拟体内的初始炎症微环境，用100ng/mL LPS刺激HCECs和HCSCs 24小时，然后用PKH67标记的2D或3D-Exos共培养24小时。激光共聚焦荧光图显示，在LPS刺激下，3D-Exos的内化比2D-Exos的内化更有效，证明了3D-Exos的优异抗炎功能。

巨噬细胞是损伤后炎症的主要介质，促进了促炎性M1表型向抗炎性M2表型的转化，更有利于减轻炎症和促进组织修复。因此需要进一步评估了3D-Exos在维持免疫稳态和通过驱动巨噬细胞极化发挥抗炎作用方面的功效。免疫荧光图显示3D-Exos组中M1标记CD86阳性细胞的百分比低于2D-Exos组和对照组，而3D-Exos组中M2标记CD206阳性细胞的百分比高于2D-Exos组和对照组。与2D-Exos和对照组相比，3D-Exos明显降低CD86的表达，增加CD206的表达。CD86和CD206表达的这些差异证实了3D-Exos有效地促进了巨噬细胞从M1表型向M2表型的极化。与2D-Exos相比，3D-Exos具有良好的免疫调节作用和体外炎症抑制作用。

 

3D-Exos的抗炎作用。(A，B) LPS刺激的 HCECs和HCSCs内化2D和3D-Exos。(C，D) 与2D和3D-Exos孵育24小时后，Raw 264.7细胞中CD86和CD206表达的免疫荧光图像。

3D-Exo水凝胶体内角膜伤口愈合评估

3D-Exo水凝胶可促进体内角膜伤口愈合
鉴于3D-Exo体外实验数据良好，在新西兰兔中建立了共存部分角膜缘间充质细胞缺损的角膜基质缺损模型，以研究3D-Exo功能化的GelMA水凝胶的治疗功效。
直径为3.0毫米、厚度为150微米的前板层角膜缺损和刮除整个角膜上皮的1/2圆周板层角膜巩膜缺损，用3D-Exo水凝胶、2D-Exo水凝胶或空白水凝胶治疗。AS-OCT显示建立角膜和角膜缘缺损成功。在治疗后1、4、7、10和13天检查组织反应和上皮形成进展。裂隙灯图像显示3D-Exo水凝胶组中的角膜几乎完全透明，这表明3D-Exo可以减轻角膜水肿。与其他组相比，荧光素染色显示3D-Exo水凝胶治疗有效地增加了伤口愈合速率，显著地改善了上皮再形成，且上皮缺陷在10天内消失。在手术后的第一天，所有的角膜都表现出明显的水肿和厚度增加，但与其他组相比，3D-Exo水凝胶治疗组基本上消除了角膜水肿。

 

功能性3D-Exo GelMA水凝胶释放系统促进了体内角膜伤口愈合。(A) 体内部分角膜缘干细胞缺损（LSCD）共存的兔角膜基质缺损研究模型设计示意图。(B) 裂隙灯显微镜和荧光素染色图像。 (C) AS-OCT 在不同时间点拍摄的空白水凝胶或2D或3D-Exo水凝胶处理的角膜的图像。(D) 每组中愈合的角膜上皮组织的面积 (百分比)。 (E) 外周基质厚度。*P < 0.05，**P < 0.01。

Anterior segment-optical coherence tomography (AS-OCT)，眼前节光学相干断层扫描：是一种非侵入性的眼科成像技术，用于眼前节高分辨率的横截面扫描，可以评估角膜的厚度、形状和结构。

3D-Exo水凝胶体内角膜伤口愈合评估

3D-Exo水凝胶在炎症和伤口愈合中的作用
部分LSCD的角膜基质缺损的修复是复杂的，涉及三个主要阶段：炎症、增殖和组织重塑。因此，需要在体内评估3D-Exo水凝胶在角膜愈合三个阶段中每个阶段的治疗效果。
局部微环境中激活的抗炎和促炎途径与激活的巨噬细胞密切相关。在手术后4天进行免疫荧光染色和qPCR分析，3D-Exo水凝胶显著降低了M1标记CD86阳性细胞的比例，而M2标记CD206阳性细胞的浸润和分布增加。促炎细胞因子IL-1β和抗炎细胞因子IL-10表达的一致趋势证实了上述现象，这归因于3D-Exos从水凝胶中持续释放。在伤口愈合过程中，M2巨噬细胞通过增加抗炎介质的分泌来加速组织再生。实验结果表明3D-Exo水凝胶在体内诱导巨噬细胞表型转化，而产生有很强的抗炎潜力。
生长因子在增殖期的组织稳态和伤口愈合中起着至关重要的作用。血小板衍生生长因子 (PDGF) 和转化生长因子(TGF-β1) 促进受损组织中细胞和基质的再生和修复，协同缩短伤口愈合时间。因此，生长因子PDGF和TGF-β1在兔角膜中的表达在手术后7天被检测到。免疫荧光和qPCR分析表明，3D-Exo水凝胶组表现出比其他组更高的PDGF和TGF-β1表达。这些发现证实了从水凝胶中释放的3D-Exos增加了PDGF和TGF-β1的表达并加速了角膜再生，这在很大程度上与体外结果一致。

 

3D-Exo水凝胶治疗的体内抗炎和再生作用。(A、B）CD86、IL-1β、CD206和IL-10的免疫荧光图。(D-G) 第4天不同治疗组的角膜的相应qPCR结果。(C) 术后7天角膜中PDGF和TGF-β1的免疫荧光图。(H，I) qPCR结果。 ****P < 0.0001。

3D-Exo水凝胶体内角膜伤口愈合评估

3D-Exo水凝胶防止疤痕形成和促进功能恢复
角膜伤口愈合的最后阶段是组织重塑，大约在受伤后3周开始，可能持续1或2年。在这一阶段，大多数活化的炎症细胞经历程序性细胞死亡或退出伤口，主要留下ECM蛋白和胶原。这些事件对于维持合成和降解之间的平衡以防止疤痕形成和促进功能恢复非常重要。
共聚焦显微镜和苏木精-伊红(H&E)染色表明，在手术后28天，所有四组中都存在上皮细胞层，尽管3D-Exo水凝胶处理组中的再生上皮比其他三组中观察到的具有更规则的排列。角膜特异性上皮角蛋白标记物CK3的表达进一步证实了3D-Exo水凝胶在角膜上皮再生中的作用。此外，如免疫荧光和qPCR所示，3D-Exo水凝胶处理的角膜呈现更多的PAX6阳性细胞，这表明角膜体内平衡。与其他三组中的角膜相比，3D-Exo水凝胶组中的角膜表现出COL-I和α-SMA表达的降低，表明3D-Exo水凝胶可以使角膜损伤期间的胶原沉积和组织纤维化最小化，从而减少基质瘢痕形成。

 

3D-Exo水凝胶治疗促进了体内角膜的形态学和细胞恢复。(A) 裂隙灯，(B) 共焦显微镜  (C) 术后28天角膜的H&E染色图。 (D-G) PAX6、CK3、COL-1和α-SMA的免疫荧光图，以及 (H-J) 第28天角膜中PAX6、COL-1和α-SMA的相对mRNA表达水平。***P < 0.001，****P < 0.0001。

 

3D-Exo水凝胶促进角膜伤口愈合的分子机制

3D-Exos通过miR-150-5p促进角膜细胞增殖并减少炎症因子释放

 

3D-Exos通过miR-150-5p促进角膜细胞增殖并减少炎症因子释放。(A) 火山图和 (B) 热图显示了3D-Exos与2D-Exos组中差异表达的miRNAs。(C) 2D-Exos和3D-Exos中miR-150-5p表达的定量分析。(D) 用miR-150-5p模拟物或抑制剂转染后48小时，MSC中miR-150-5p表达的qPCR分析。(E，F) 用miR-150-5p模拟物或抑制剂转染后，CCK-8测定HCECs和HCSCs的细胞活率。(G-J) 用miR-150-5p模拟物或抑制剂转染48小时后，LPS刺激的HCECs和HCSCs中IL-1β和IL-10的mRNA水平。**P < 0.01，***P < 0.001和****P < 0.0001。

 

3D-Exo水凝胶促进角膜伤口愈合的分子机制

PDCD4是miR-150-5p的直接靶基因

 

PDCD4是miR-150-5p的直接靶基因。(A) 维恩图显示了使用不同数据库确定的miR-150-5p预测靶标。(B) PDCD4 3’UTR中miR-150-5p的结合序列。(C) 双荧光素酶活性分析证实了miR-150-5p和PDCD4之间的关系。(D) 在用miR-150-5p模拟物、NC、抑制剂或抑制剂NC转染48小时后，HCECs、HCSCs和LPS刺激的HCECs和HCSCs中PDCD4的蛋白质和 (E-H) mRNA水平。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001和****P < 0.0001。

03 
研究方法
1. 2D-Exo、3D-Exo、GelMA水凝胶等物料准备与表征
2D和3D培养体系建立，并对MSC细胞进行鉴定，用于后续生产2D-Exo和3D-Exo；合成了GelMA水凝胶，用于3D细胞培养和3D外泌体负载。
2. 分离的2D和3D MSC外泌体，并鉴定和表征，同时进行外泌体-细胞摄取
3. 确定3D-Exos可以促进HCEC和HCSC的增殖和迁移在加速角膜伤口愈合
HCEC和HCSC的增殖和迁移在加速角膜伤口愈合中起着至关重要的作用此外，用MSC-Exos进行划痕伤口测定，以评估其加速体外细胞迁移的能力，其中伤口愈合基于剩余的无细胞面积作为细胞迁移速率的替代来量化。确定3D-Exos的HCEC和HCSCs划痕愈合能力。
4. 证实3D-Exos可以维持角膜细胞表型
在正常情况下，角膜细胞是静态的，LSC负责维持角膜上皮平衡，以防止ECM的过度分泌，从而确保角膜上皮和基质的动态平衡，促进角膜透明。然而，这种正常的生理平衡可以被对称或不对称分裂的LSC破坏；此外，角膜细胞在对各种环境刺激的反应中转化为成肌纤维细胞。因此需要评估2D-Exos和3D-Exos对人类原代LSC (CK3、CK12、P63和PAX6) 和HCSCs (Keratocan (KERA)、Lumican (LUM)、Decorin (DCN)和α-SMA) 相关蛋白和基因表达的影响。
通过免疫荧光检测间充质细胞标记P63和PAX6阳性的LSC数量和分化标记CK3和CK12阳性的LSC的数量，来评估3D-Exos是否可以维持LSCs的干细胞性，同时抑制它们分化为终末成熟的角膜上皮细胞。确定3D-Exos是否可以维持角膜细胞表型。
5. 证实3D-Exos可以调节早期炎症反应

过度活化的HCECs和HCSCs释放的炎性因子通常会阻碍伤口愈合，导致ECM降解甚至形成慢性伤口。调节早期炎症反应可能有助于维持角膜损伤后局部微环境的稳态，这不仅有利于角膜上皮愈合，也有利于减少疤痕。
用LPS刺激HCECs和HCSCs，模拟体内的初始炎症微环境，然后检测与2D-Exos和
3D-Exos在这两种细胞的摄取情况。
同时检测与2D-Exos和3D-Exos与Raw 264.7细胞孵育后，含CD86标志物的M1型巨噬细胞和含CD206标志物的M2型巨噬细胞百分比。证实了3D-Exos促进了巨噬细胞从M1表型向M2表型的极化，具有良好的免疫调节作用和体外炎症抑制作用。
6.  3D-Exo水凝胶在炎症和伤口愈合中的作用
部分LSCD的角膜基质缺损的修复是复杂的，涉及三个主要阶段：炎症、增殖和组织重塑。因此，需要在体内评估3D-Exo水凝胶在角膜愈合三个阶段中每个阶段的治疗效果。局部微环境中激活的抗炎和促炎途径与激活的巨噬细胞密切相关，需要评估3D-Exo水凝胶在炎症阶段对巨噬细胞表型转化的影响，以及促炎细胞因子IL-1β和抗炎细胞因子IL-10的表达，来证明3D-Exo水凝胶在体内诱导巨噬细胞表型转化和抗炎潜力。
生长因子在增殖期的组织稳态和伤口愈合中起着至关重要的作用。血小板衍生生长因子 (PDGF) 和转化生长因子(TGF-β1) 促进受损组织中细胞和基质的再生和修复，协同缩短伤口愈合时间。因此，通过免疫荧光和qPCR实验检测3D-Exo水凝胶的PDGF和TGF-β1表达水平。

角膜伤口愈合的最后阶段是组织重塑，大约在受伤后3周开始，可能持续1-2年。在这个阶段，大多数活化的炎症细胞经历程序性细胞死亡或退出伤口，主要留下ECM蛋白和胶原。这些事件对维持合成和降解间的平衡以防止疤痕形成和促进功能恢复至关重要。
验证了3D-Exo水凝胶在手术后28天的角膜伤口愈合过程中调节组织重塑的能力。通过体内裂隙灯成像、AS-OCT和共焦显微镜评估的在重塑过程中3D-Exo-水凝胶处理的角膜比其他组角膜的透明程度和角膜基质疤痕情况。
7.  3D-Exo水凝胶促进角膜伤口愈合的分子机制
通过对比分析2D和3D-Exo转录组表达水平差异，确定关键分子miR-150-5p，然后在细胞水平证实miR-150-5p可以促进角膜细胞增殖并减少炎症因子释放。
检索数据库和生信分析其可能的miR-150-5p靶标，并用双荧光素酶活性分析证实了miR-150-5p和PDCD4之间的关系。并在LPS刺激的HCECs和HCSCs中检测PDCD4蛋白质和  mRNA表达水平证实，PDCD4是miR-150-5p的直接靶标。

 

04 
结论
3D-MSC-Exo GelMA水凝胶可以抑制免疫炎症，促进角膜再生修复，并且基本上没有疤痕形成，最终以多维方式加速了共存部分LSCD角膜基质缺损的修复。
富含miR-150-5p的3D-MSC-Exos通过靶向PDCD4促进角膜细胞增殖并减少炎症因子释放，最终实现受损角膜的多维修复。
3D-MSC-Exo GelMA水凝胶的持续释放系统是一种用于综合治疗损伤角膜的有效的无细胞组织工程策略，为临床角膜伤口愈合提供了新的见解。
3D-MSC-Exos的治疗效果优于2D-MSC-Exo，这对我们后续外泌体的生产和其他适应症的临床应用提供了新方向。