外泌体抗衰 | 外泌体逆转衰老细胞的增殖实现返老还童
01
背景
衰老是一个内在的生物学过程，其特征是全身性改变，逐渐损害生理完整性，增加对年龄相关疾病的易感性，最终导致死亡。
衰老的特征包括细胞衰老、基因组不稳定、表观遗传改变、蛋白稳态丧失、间充质细胞衰竭、慢性炎症和细胞间通讯改变。
其中， 由各种应激物触发的细胞周期停滞是衰老的重要驱动因素。衰老细胞 (SNC) 在衰老过程中积累，并分泌衰老相关的分泌表型 (SASP)，促进继发性衰老并破坏正常组织功能。因此，靶向SnCs已成为延长寿命和延缓年龄相关疾病发作的一种有前途的策略。
靶向SNCs的疗法大致分为两大类：消除SNCs 和抑制病理性SASP信号。
这些策略已显示出对衰老和相关疾病的治疗益处，包括延长寿命、减轻炎症和改善认知。但这些方法也有一定的局限性。
虽然这些策略可以有效地消除缺乏的SNC，但随着个体年龄的增长，SNC在组织中的占比会增加。消除SNC可能会导致相当大的组织损伤并损害正常的器官功能。此外，尽管抑制SASP具有再生效果，但它会妨碍对病原体和癌细胞的免疫监视。开发针对SNC的新再生策略对于应对这些挑战至关重要。
虽然细胞衰老通常被认为是不可逆的，但新兴的研究表明，特定细胞类型的衰老可能是动态的，允许SNC重新进入细胞周期并恢复正常功能。然而，逆转SNC增殖停滞对恢复衰老的潜在贡献仍未探索。
此外，越来越多的证据表明，人类胚胎干细胞衍生的外泌体 (hESC-Exos) 在局部组织 (如海马体和骨髓) 中具有再生和恢复作用。先前的研究表明，hESC-Exos包含许多负载蛋白和微小核糖核酸(miRNAs )，这些蛋白和微小核糖核酸被预测可调节衰老和增殖。
因此，我们提出了一种新的再生策略，称为Senoreverse，旨在逆转SnCs的增殖停滞并实现再生。使用hESC-Exos治疗以SnCs为目标是一种在Senoreverse策略中潜在可行的方法。
02
研究数据
作者提出了一种新的再生策略，称为Senoreverse，旨在逆转SNCs的增殖停滞并实现再生。使用hESC-Exos治疗以SNCs为目标是一种在Senoreverse策略中潜在可行的方法。
间充质细胞外泌体使衰老的IMR-90细胞恢复活力
hESC-Exos使衰老的IMR-90细胞恢复活力 (A) hESC-Exos处理衰老的PDL50 IMR-90细胞的示意图。PDL30 IMR-90细胞作为年轻对照。 (B) PDL 30-Ctrl、PDL50-PBS和PDL50-Exos IMR-90细胞的SA-b-gal染色。(C) SA-b-gal染色阳性细胞的比例。每个实验使用六个独立的生物重复。 (D)衰老相关基因的RT-qPCR分析。PDL50-PBS和PDL50-Exos IMR-90细胞中的基因表达被标准化为PDL30-Ctrl IMR-90细胞中的基因表达。 (E) PDL 30-Ctrl、PDL50-PBS和PDL50-Exos IMR-90细胞中p21和p16的蛋白质印迹分析。GAPDH用作加载对照。 (F) p21和p16表达相对于GAPDH表达的定量。 (G) PDL 30-Ctrl、PDL50-PBS和PDL50-Exos IMR-90细胞的生长曲线。 (H) PDL 30-Ctrl、PDL50-PBS和PDL50-Exos IMR-90细胞中Ki67的免疫荧光图像。(I) Ki67阳性细胞的定量。 (J) PDL 30-Ctrl、PDL50-PBS和PDL50-Exos IMR-90细胞的FCM细胞周期分析。 (K)(J) 中S期细胞百分比的统计分析。 (L) 火山图显示了PDL50-PBS和PDL50-Exos IMR-90细胞之间的基因表达差异。 (M) 对来自 (H) 的不同表达的基因进行分析。 (N) PDL 50-PBS和PDL50-Exos IMR-90细胞中细胞周期模块的GSEA评分。
间充质细胞外泌体逆转SNCs的增殖停滞
hESC-Exos以单细胞分辨率逆转SNCs增殖停滞 (A) 产生p21-YFP衰老报道细胞系的示意图。 (B) 通过FCM对YFP阳性的SNC进行分类。 (C) 在对照组、Dox-Exos和Dox-PBS p21-YFP LO2细胞中Ki67和p21的免疫荧光图像。 (D) 从scRNA-seq推断的细胞周期轨迹。 (E) 显示不同细胞周期阶段的细胞比例的堆积条形图。 (F) 细胞的UMAP可视化。 (G) 显示细胞亚群比例的柱状图。 对照组，p21-未经Dox处理的YFP LO2细胞。Dox-Exos，暴露于hESC-Exos的Dox处理的p21-YFP LO2细胞。然后将Dox处理的p21-YFP LO2细胞与PBS一起孵育。Sen，衰老细胞；Int，处于中间状态的细胞；Rej，更新细胞。
间充质细胞外泌体治疗使衰老小鼠恢复活力
hESC-Exos治疗使衰老小鼠恢复活力 (A) 从20个月开始接受hESC-Exos或PBS给药的小鼠的示意图。第30个月被设定为测试点。 (B) 老化PBS和老化Exos组的存活曲线。 (C) 对20至30个月的小鼠进行动态体重监测。(D) 从第28个月到第30个月，每10天进行一次旋转杆试验，条件是在300秒内将转速从8rpm增加到80rpm。 (E) 在第30个月，在25rpm的固定速度下，老化PBS组和老化Exos组之间的下降时间的比较。 (F) 从第28个月到第30个月，每10天进行一次握力测试。使用小鼠的体重对四肢力量进行标准化。 (G) 在有平台的情况下小鼠的游泳路径 (学习阶段)。 (H) 避免学习阶段的潜伏期。 (I) 在没有平台的情况下小鼠的游泳路径 (记忆阶段)。 (J) 小鼠在每个象限花费的时间。(K) ELISA测定法检测血清中炎症因子的水平。 (L) 肾、肝、肺、脾和皮肤组织的SA-b-gal染色分析。左图，SA-b-gal的代表性显微照片。右图，对SA-b-gal染色阳性信号的定量。
间充质细胞外泌体治疗重塑了衰老小鼠细胞的增殖过程
hESC-Exos治疗重塑了衰老小鼠细胞的增殖过程 (A) 显示不同细胞周期阶段肝脏和皮肤中细胞亚群比例的堆积条形图。 (B) 维恩图显示与老化、Exos和逆转细胞周期相关的显著差异表达基因数量。重叠区域表示下调的逆转CCGs (顶行) 和上调的逆转CCGs (底行) 的数量。 (C) 文氏图描绘了肝脏和皮肤组织之间共享的下调的逆转CCGs (顶部) 和上调的逆转CCGs (底部)。 (D和E) 跨Int-to-Sen (右箭头) 和Int-to-Rej (左箭头) 的肝脏(E) 和皮肤 (F) 差异基因热图。通过分级聚类 (k=2) 分组，基因共表达模块和来自每个模块的样本基因被标记 (右) 。Sen，衰老细胞；Int，处于中间状态的细胞；Rej，更新细胞。 (F) 肝脏和皮肤中p21 (左绿色)、Ccng2 (右绿色)、Ki67 (樱桃红) 和DAPI (蓝色) 的代表性免疫荧光显微照片；左图，对荧光信号进行量化。Cell Cycle-related Gene (CCGs)
间充质细胞外泌体是通过miR-302b抑制细胞周期检查点Cdkn1a和Ccng2
hESC-Exos中富集的miR-302b抑制细胞周期检查点Cdkn1a和Ccng2。(A) hESC-Exos中的前五名miRNAs。 (B) 在miR-302b转染的IMR-90细胞中使用Ago2 Clip-seq鉴定miR-302b靶的工作流程示意图。 (C) 使用生物信息学策略鉴定miR-302b和靶mRNAs的3’ UTR之间的结合位点。 (D) miR-302b候选目标的GO富集网络。灰色节点和边缘表示miR-302b的候选目标。各个路径用橙色节点表示。 (E) miR-302b和Cdkn1a (左) 或Ccng2 (右) 的3’ UTR之间的碱基配对。红色箭头表示Cdkn1a或Ccng2的3’ UTR中的突变位点。 MFE，最小自由能(黑色：miR-302b和WT 3’ UTR片段之间的MFE；红色：miR-302b和突变体3’ UTR片段之间的MFE)。 (F) 在用miR-302b模拟物和含有野生型或突变体的荧光素酶报告质粒共转染的IMR-90细胞中测量荧光素酶活性。 (G) qPCR检测IMR-90细胞中miR-302b含量。(H) 用不同处理对IMR-90细胞进行SA-b-gal染色。 (I) 定量SA-b-gal染色阳性细胞的百分比。(J) FCM描绘了用不同处理的IMR-90细胞的细胞周期分布。 (K)(J) S期百分比的统计分析。 (L) 用不同处理的IMR-90细胞中p21和Ccng2表达的蛋白质印迹分析。(M)(L) p21和Ccng2表达相对于GAPDH的定量。用miRNA阴性对照 (NS-m)或miR-302b模拟物 (302b-m) 转染(G–M) IMR-90细胞48小时。
miR-302b治疗使衰老小鼠恢复年轻
miR-302b治疗使衰老小鼠返老还童。 (A) 通过电穿孔用miR-302b模拟物转染293F衍生的外泌体，命名为Exos-302b。阴性对照通过电穿孔用miRNA转染293F衍生的外泌体，命名为Exos-NC。 (B) 从25个月开始接受Exos-302b或Exos-NC给药的小鼠的示意图。将第30个月设定为测试点。 (C) 施用Exos-302b或Exos-NC后25至30个月的小鼠的形态学变化。 (D) 对25至30个月的小鼠进行体重动态监测。 (E) 从第25个月到第30个月，在300秒内将转速从8rpm增加到80rpm的条件下，每月进行旋转杆试验。
03
结论
1. 在hESC-Exos中miR-302b靶向Cdkn1a/Ccng2，逆转衰老细胞增殖停滞。
2. miR-302b延长寿命并改善衰老小鼠的体能和认知。
3. 长期miR-302b治疗显示在24个月期间没有增加疾病或肿瘤负担。
4. 抗衰策略-逆转SnCs增殖停滞，实现年轻化。
