Bioact Mater|温医大团队：外泌体赋能递药！激活Nrf2通路+抗氧化

今天分享的是发表在【BioactMater】（IF：20.3）上题为“Cell-penetrating peptide-functionalized biomimetic nanovesicles for efficient cataract treatment via enhanced corneal penetration and lens-mitochondria dual targeting”的研究。本研究构建细胞穿透肽（PENE）功能化的脂质-外泌体杂化仿生纳米递送系统（LSPE@Cur），整合脂质体高载药效率、外泌体同源靶向性及PENE角膜穿透与线粒体靶向能力，实现“角膜黏附-屏障穿透-晶状体-线粒体”双重靶向递送，为白内障防治提供新型纳米药物策略。

图1A：紫外-可见光谱显示，LS@Cur、LSP@Cur、LSE@Cur、LSPE@Cur均在421nm处出现姜黄素特征吸收峰，证实药物稳定封装。

图1B：傅里叶红外光谱显示，LSP@Cur和LSPE@Cur在3200-3600cm⁻¹（N-H伸缩振动）、1750cm⁻¹（C=O伸缩振动）及1350cm⁻¹（CH₃对称弯曲振动）处出现PENE修饰特征峰，证实PENE成功锚定。

图1C：纳米颗粒追踪分析（NTA）显示，外泌体（Exo）浓度为2.9×10¹⁰particles/mL，LSP@Cur和LSPE@Cur浓度达2.2×10¹¹particles/mL。

图1D：荧光模式NTA显示，DiO标记的Exo荧光信号为2.7×10¹⁰particles/mL，LSPE@Cur荧光阳性颗粒达1.8×10¹¹particles/mL，证实外泌体膜蛋白成功整合。

图1E：zeta电位分析显示，LS@Cur电位为-7.8±0.35mV，PENE修饰后LSP@Cur电位升至-2.0±0.3mV，LSPE@Cur电位与LSP@Cur存在2.8mV差异，提示外泌体膜整合导致表面电荷重分布。

图1F：扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）显示，Exo、LS@Cur、LSP@Cur、LSE@Cur、LSPE@Cur均呈球形结构，Exo粒径约50nm，其余四种纳米囊泡粒径约100nm，均具有磷脂双层结构。

图1G：动态光散射（DLS）显示，Exo hydrodynamic直径集中在100nm左右，其余四种纳米囊泡粒径分布为100-300nm，14天稳定性监测显示LSPE@Cur无明显粒径和电位波动。

图1H：ABTS抗氧化能力检测显示，Cur及其纳米制剂的自由基清除能力达Trolox的2.5倍，证实纳米封装未影响姜黄素活性。

图1I：DPPH自由基清除实验显示，LSPE@Cur干预后517nm处特征吸收峰6分钟内快速下降，30分钟持续衰减，溶液由紫色变为淡黄色。

图1J：石英晶体微天平（QCM-D）分析显示，LSP@Cur和LSPE@Cur与黏蛋白结合后出现显著负频移，提示强黏附能力，而LS@Cur和LSE@Cur与黏蛋白结合后易被洗脱。

图1K-L：黏蛋白共孵育实验显示，LSP@Cur和LSPE@Cur孵育1小时后出现浊度和相分离，zeta电位显著负移；照片显示60分钟时两组仍保持黏附状态，LS@Cur和LSE@Cur已分散。

图1M：Western blot显示，Exo、LSE@Cur、LSPE@Cur均高表达外泌体标志物CD9、CD63、Alix，证实外泌体膜蛋白成功保留。

图1N：定量分析显示，LSE@Cur和LSPE@Cur中外泌体蛋白保留率约80%。

这些结果表明，成功制备的LSPE@Cur纳米囊泡具有典型球形结构和良好稳定性，PENE修饰增强黏蛋白结合能力，外泌体膜整合保留靶向相关蛋白，且有效封装姜黄素并维持其抗氧化活性。

图2A-B：IDT显微镜动态观察显示，HCECs与LSP@Cur、LSPE@Cur共培养0-4小时，紧密连接被破坏，而Exo、LS@Cur、LSE@Cur组及对照组紧密连接持续形成。

图2C：免疫荧光染色显示，LSP@Cur、LSPE@Cur处理2小时后，紧密连接蛋白ZO-1荧光连续性断裂，β-微管蛋白边缘模糊；4小时后ZO-1重新形成环状结构，微管网络重组。

图2E：F-actin免疫荧光显示，LSP@Cur、LSPE@Cur组细胞间荧光带变窄，应力纤维解聚并出现点状结构，提示细胞骨架重组和侧向收缩。

图2F：Western blot显示，共培养4小时后，HCECs中Smad2/3表达显著下调，ZO-1表达升高，提示TGF-β/Smad信号轴与紧密连接稳态存在调控网络。

图2G：Transwell体外角膜屏障模型示意图，上室为HCECs单层，下室为HLECs单层。

图2H-I：流式细胞术显示，LSP@Cur和LSPE@Cur组下室HLECs中Cur荧光强度显著高于LS@Cur和LSE@Cur组，穿透效率达150%。

这些结果表明，PENE修饰可通过短暂的可逆开放紧密连接、调控细胞骨架重组，协同增强LSPE@Cur的角膜穿透能力，显著提升药物跨上皮-内皮屏障递送效率。

图3A：IDT显微镜显示，游离香豆素-6（C6）进入HLECs后主要包裹于胞饮小泡，LS@C6和LSPE@C6可有效分散至细胞质。

图3B-D：流式细胞术显示，LSE@Cur、LSPE@Cur被HLECs摄取量约为LS@Cur、LSP@Cur的2倍，而在HCECs和RPEs中摄取量无显著差异。

图3C：竞争摄取实验显示，HLECs、HCECs、RPEs共培养时，LSE@Dio和LSPE@Dio被HLECs摄取量显著高于其他两种细胞。

图3E：免疫荧光共定位显示，LSPE@C6与线粒体（Mito-Tracker标记）存在显著共定位，药物峰与线粒体峰重叠，而C6和LS@C6组无明显重叠。

图3F：Western blot显示，LSPE@Cur处理后HLECs中线粒体膜标志物TOMM20表达上调。

图3G：IDT显微镜显示，LSPE@C6与线粒体大量共定位，游离C6和LS@C6组无明显共定位。

这些结果表明，LSPE@Cur通过外泌体膜上整合素和跨膜转运蛋白实现HLECs同源靶向，且PENE修饰赋予其高效线粒体靶向能力，促进药物胞内有效分散和亚细胞定位。

图4A：蛋白质组学亚细胞定位分析显示，与Cur组相比，LSPE@Cur组HLECs中259种线粒体相关蛋白显著上调。

图4B：线粒体相关蛋白热图显示，LSPE@Cur组线粒体蛋白表达显著升高，LS@Cur组无明显变化。

图4C：GO通路富集分析显示，差异表达蛋白主要富集于线粒体膜和转运相关功能。

图4D：火山图显示，Cur、LS@Cur、LSPE@Cur组间差异蛋白以线粒体膜和转运相关蛋白为主。

图4E：气泡图显示，LSPE@Curvs Cur组中10个差异最显著的线粒体相关基因，桑基图显示其关联信号通路主要涉及线粒体功能调控。

图4F：Mfuzz时序聚类分析显示，LSPE@Cur诱导的4个线粒体蛋白簇（Cluster1-4）呈现同步表达模式，调控动力学显著优于LS@Cur。

图4G：气泡图和热图显示，LSPE@Cur vs Cur组中差异最显著的10个基因包含A8K651和A0A384NL93两种线粒体相关基因，且均显著上调。

这些结果表明，LSPE@Cur具有特异性线粒体靶向能力，可显著调控线粒体膜蛋白和转运蛋白表达，且调控具有时空同步性和稳定性。

图5A：Calcein/PI双染色显示，200μM H₂O₂处理后HLECs存活率降至80%，红色死亡细胞增多；Cur、LS@Cur、LSPE@Cur预处理后活细胞（绿色）比例显著升高，LSPE@Cur组保护效果最优。

图5B-D：DCFH-DA探针检测显示，H₂O₂诱导后HLECs内ROS荧光强度显著升高，Cur及其纳米制剂可有效抑制ROS过度生成，LSPE@Cur组抑制效果最显著。

图5C：CCK-8实验显示，Cur、LS@Cur、LSPE@Cur预处理后HLECs活力显著高于PBS组，LSPE@Cur组活力接近正常水平。

图 5E-F：Western blot显示，LSPE@Cur处理后HLECs中 Nrf2、CAT表达显著上调。

图5G-H：Western blot显示，H₂O₂损伤后，Cur预处理组CAT表达进一步升高，LSPE@Cur组Nrf2和CAT表达水平显著高于Cur组和LS@Cur组。

图5I-J：JC-1线粒体膜电位检测显示，H₂O₂处理后绿色单体增多（膜电位去极化），Cur、LS@Cur、LSPE@Cur预处理可减少绿色荧光、增加红色聚集态，LSPE@Cur组膜电位与正常对照组无显著差异。

图5K：线粒体-溶酶体共定位分析显示，H₂O₂处理后线粒体（红色）与溶酶体（绿色）共定位率显著升高，Cur组共定位率降低，LSPE@Cur组共定位模式与正常细胞高度相似。

图5L：IDT显微镜显示，H₂O₂处理4小时后PBS组HLECs膜破裂，自噬体增多，线粒体荧光模糊；LS@Cur组部分细胞膜破裂，线粒体荧光相对清晰；LSPE@Cur组细胞活力良好，线粒体和溶酶体形态完整，分布均匀。

这些结果表明，LSPE@Cur可通过激活Nrf2信号通路上调抗氧化酶表达、清除ROS，同时稳定线粒体膜电位、抑制异常自噬，双重保护HLECs免受氧化应激损伤。

图6A：裂隙灯显微镜观察显示，连续9天给药后，LS@Cur和LSPE@Cur组大鼠眼表结构完整、透明度高、红光反射强，无明显炎症反应。

图6B：角膜OCT显示，给药9天后实验组角膜三维结构完整，中央厚度与健康对照组无显著差异。

图6C：视网膜电图（ERG）显示，暗适应0.01/3.0ERG和明适应3.0Flicker 30 Hz ERG波形正常，杆状细胞和锥状细胞功能在正常波动范围内。

图6D：视网膜OCT显示，实验组视网膜层状结构完整，黄斑中心凹保持生理形态，组织连续性和厚度分布与对照组一致。

图6E：视网膜OCTA显示，实验组浅层毛细血管丛密度正常，深层毛细血管灌注均匀，黄斑无血管区边界清晰，外周血管形态符合生理曲率。

图6F：多模式晶状体显微镜显示，长期给药未改变晶状体形态参数和光学特性。

图6G：HE染色显示，实验组角膜、虹膜、视网膜组织结构完整，无炎症浸润和病理改变。

这些结果表明，LSPE@Cur具有优异的体内眼部生物相容性，可维持眼表透明度、视网膜功能和眼内微环境稳态，无明显组织毒性。

图7A：裂隙灯和OCT显示，LS@Floures滴注后2分钟结膜囊仍有药物滞留，LSPE@Floures滴注5分钟后角膜表面滞留量显著更高。

图7B-C：体内荧光成像显示，游离DiR组10分钟内荧光强度下降83%，LS@Dir组下降61%，LSPE@Dir组下降49%；30分钟时LSPE@Dir仍保留40%相对荧光强度。

图7D：角膜共聚焦显示，LSPE@C6可有效穿透角膜屏障，荧光分布于角膜各层，LS@C6穿透能力较弱。

图7E-F：晶状体切片荧光显示，LSPE@C6可穿透晶状体囊膜，核心区域荧光强度为LS@C6的2倍以上；LSPE@C6组整个晶状体呈绿色荧光，LS@C6组仅晶状体皮质区有荧光。

图7G：角膜免疫组化显示，LSPE@Cur组上皮钙黏蛋白（E-cadherin）免疫信号显著低于健康对照组，黑色箭头标注角膜上皮和基质中钙黏蛋白分布。

图7H：ZO-1免疫荧光显示，健康对照组角膜上皮细胞边界ZO-1信号连续，LSPE@Cur组ZO-1呈细胞质分散分布。

图7I：GSEA分析显示，LSPE@Cur处理组眼组织中CHR8E1基因集显著富集，热图显示富集蛋白包括二肽酶、WD重复域59等与细胞连接调控相关的分子。

这些结果表明，LSPE@Cur通过增强角膜黏附延长眼部滞留时间，通过短暂的调控角膜细胞连接促进屏障穿透，最终实现晶状体靶向递送，显著提升药物在晶状体的富集效率。

图8A：裂隙灯显示，UVB诱导后PBS组第5天透光率显著下降，第7天出现轻度混浊，第9天完全混浊；LS@Cur组第7天后透明度逐渐下降；LSPE@Cur组全程维持正常透光率。

图8B：晶状体OCT显示，PBS组出现皮质性白内障特征（前囊膜边界模糊），LS@Cur和LSPE@Cur组晶状体透明度维持正常。

图8C：多角度光照显示，PBS组晶状体显著混浊，LS@Cur和LSPE@Cur组光学透明度与健康对照组相当。

图8D：晶状体免疫荧光显示，UVB诱导后CAT表达升高，LS@Cur和LSPE@Cur组CAT荧光强度进一步增强。

图8E：晶状体免疫荧光显示，LSPE@Cur组SOD表达显著高于PBS组和LS@Cur组。

图8F：KEGG富集弦图显示，LSPE@Cur+UVB组vs PBS+UVB组差异蛋白显著富集于氧化磷酸化通路。

图8G：Reactome分析显示，两组差异蛋白主要关联呼吸链复合体、转运等氧化应激相关通路。

图8H：GO富集热图显示，LSPE@Cur组眼部组织中抗氧化酶相关蛋白显著上调。

图8I：GO富集分析显示，LSPE@Cur组线粒体膜蛋白和氧化还原酶表达显著升高。

这些结果表明，LSPE@Cur可通过上调晶状体抗氧化酶（SOD、CAT）表达、激活氧化磷酸化通路，有效抑制UVB诱导的氧化应激损伤，显著延缓甚至阻止白内障形成。

本研究成功构建了细胞穿透肽功能化的脂质-外泌体杂化仿生纳米递送系统LSPE@Cur，该系统整合PENE的黏蛋白亲和性与角膜穿透能力、外泌体的晶状体同源靶向能力及脂质体的高载药效率，实现“角膜黏附-屏障穿透-晶状体-线粒体”的双重靶向递送。LSPE@Cur通过PENE的阳离子结构短暂的可逆开放角膜紧密连接，借助外泌体膜上整合素和跨膜转运蛋白精准靶向晶状体上皮细胞，再通过PENE的线粒体靶向序列将姜黄素递送至线粒体，通过激活Nrf2信号通路上调SOD、CAT等抗氧化酶表达，清除ROS，稳定线粒体膜电位，抑制异常自噬，从源头维持晶状体氧化应激稳态。体内外实验证实，LSPE@Cur具有优异的生物相容性，可显著提升姜黄素的眼部滞留和晶状体富集效率，有效预防UVB诱导的白内障形成。该研究为白内障的非侵入性药物治疗提供了新型纳米策略，也为眼部靶向递送系统的设计提供了“结构仿生-功能协同-机制互补”的新思路。