穴区外泌体在电针促进多裂肌损伤肌肉再生修复中的作用

目的：观察电针对多裂肌损伤模型大鼠肌肉再生修复的影响，探讨穴区外泌体在针刺调节中的作用。

方法：将40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、电针组、抑制剂组，每组10只。模型组、电针组和抑制剂组采用0.5%布比卡因肌肉注射制备多裂肌损伤模型。电针组和抑制剂组分别予以电针“委中”和“肾俞”治疗，疏密波，频率2Hz/10Hz，1mA，每次20min，1次/d，连续干预7d。抑制剂组在每次电针前1h予双侧“委中”和“肾俞”穴位注射外泌体抑制剂GW4869（3 mg/mL，50µL/穴）。造模后第7天取多裂肌，HE染色观察多裂肌组织形态变化，Masson染色观察多裂肌胶原纤维，免疫组织化学法观察配对盒转录因子7（Pax7）、成肌分化抗原（MyoD）的阳性表达，提取各组大鼠血清外泌体并采用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析技术（NTA）进行鉴定，Western blot法检测各组大鼠多裂肌组织中肌细胞生成素（MyoG）、肌球蛋白重链（MyHC）及血清外泌体中CD63、程序性细胞死亡因子6相互作用蛋白（Alix）、肿瘤易感基因101蛋白（TSG101）的表达。

结果：模型组大部分肌纤维变性坏死，肌纤维周围可见大量炎性细胞浸润，可见大片蓝染胶原纤维；电针组肌纤维形态较完整，新生肌纤维较多，损伤区炎性细胞减少，胶原纤维明显减少；抑制剂组肌纤维破坏及炎性细胞浸润仍较多，可见直径不均的新生肌纤维，胶原纤维较多。TEM、NTA及Western blot的结果均显示外泌体提取成功，电镜下其形态为典型茶托样，粒径范围集中分布在70~200nm，标志蛋白CD63、Alix、TSG101均为阳性。与正常组比较，模型组多裂肌中Pax7的表达，血清外泌体Alix、CD63表达升高（P<0.01，P<0.05，P<0.001）。与模型组比较，电针组多裂肌中Pax7、MyoD、MyoG、MyHC表达，血清外泌体Alix、TSG101表达显著升高（P<0.01，P<0.05）。与电针组比较，抑制剂组多裂肌中Pax7、MyoD、MyoG、MyHC表达，血清外泌体TSG101、CD63表达显著降低（P<0.01，P<0.05，P<0.001）。
       结论：电针能显著上调损伤多裂肌Pax7、MyoD、MyoG和MyHC的表达，促进腰多裂肌再生修复，该作用可能与穴区外泌体释放有关。

FBSS是指在进行一次或多次腰椎手术之后，患者由于各种原因出现腰骶部疼痛及下肢放射痛等症状。FBSS的致病原因较为复杂，近年来大量研究显示在诊断明确、手术计划合理的情况下，术中导致的椎旁多裂肌损伤或是FBSS的主要诱因之一。因此，探讨如何促进手术引起的脊旁多裂肌的损伤修复，对防止患者术后出现新的疼痛及功能障碍有重要意义。

多裂肌位于脊柱两旁竖脊肌深部，是附着面积最大的椎旁肌群。腰椎后路手术时，对该肌肉长时间的牵拉和剥离可直接导致多裂肌损伤。多裂肌是位于脊旁的重要稳定肌，也是足太阳经筋“上挟脊上项”的必经之路。针灸是临床治疗骨骼肌损伤的有效方法之一，课题组前期已证实临床应用针刺疗法治疗FBSS患者的腰痛疗效确切。委中和肾俞为临床治疗腰部疾病的特效穴，“腰背委中求”是委中对腰背部疾病特异性疗效的经验总结。委中为足太阳膀胱经合穴，足太阳膀胱经脉“从腰中，下夹脊，贯臀，入腘中”，膀胱经自腰背而来的两条支脉皆下合于委中，根据“经脉所过，主治所及”，针刺委中能疏调腰背之气。肾俞为肾的背俞穴，为肾气在腰部输注、转输之所，“腰为肾之府”，故取肾俞进行干预可疏导局部之经气，调和局部气血。委中和肾俞相配属远近配穴，可相得益彰，增强疗效。

骨骼肌损伤后都必然经历坏死性炎性反应、肌纤维再生修复与骨骼肌纤维细胞外基质重塑阶段。其中，坏死性炎性反应期出现较早，从损伤即刻持续到损伤后10d前后，主要表现为肌纤维坏死，中性粒细胞和巨噬细胞浸润；随后，巨噬细胞持续吞噬，肌肉纤维逐步再生，瘢痕组织开始出现。本研究中HE和Masson染色显示造模后大鼠多裂肌肌纤维断裂、排列紊乱，并有大量炎性细胞浸润及蓝染胶原纤维形成，提示多裂肌在布比卡因盐酸盐注射造模后发生严重的炎性反应及纤维化；而电针组炎性细胞数目明显减少，且新生肌肉纤维数量增多，排列更加规整，说明电针局部组织已经处在成肌分化状态，而模型组局部还处于肌细胞再生阶段。与同一时间点模型组比较，电针组比模型组恢复更快，表明电针能够有效降低多裂肌损伤局部的反应，促进多裂肌形态修复，此结果与我们前期研究结果一致。然而，注射外泌体抑制剂后，抑制剂组肌纤维破坏及炎性细胞浸润程度与电针组相比明显升高，说明注射外泌体抑制剂会使电针促进多裂肌再生修复的疗效下降。

外泌体是一种磷脂双分子层细胞外囊泡，直径在30~150nm之间，它可以携带多种生物信息物质与周边靶细胞进行信息交流，或经血液、体液运输到远处靶细胞，是神经、内分泌、免疫等细胞间相互通讯的重要载体。外泌体物质多、效应多、联系多的特性与针刺多靶点、多途径、多系统共同发挥整体调节作用的特点不谋而合。本研究采用透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析技术及Western blot法检测外泌体形态学、粒径大小及标志蛋白并进行外泌体鉴定。本研究结果表明，各组大鼠血清提取的外泌体形态大小和粒径都符合理论标准，外泌体的3种重要标志蛋白CD63、Alix、TSG101均出现明显条带，表明所提取的外泌体未受杂蛋白干扰，可用于相关生物学分析。同时，电针组Alix、TSG101的表达显著高于模型组，表明电针可在一定程度上促进多裂肌损伤后外泌体的分泌，而在穴区局部使用外泌体抑制剂后，电针对外泌体的促释放效应显著下降。此外，电针组CD63表达在数值上低于模型组，虽未达统计学差异，但可能反映了电针对外泌体亚群或蛋白分选的特异性调控，其意义有待深究。

Pax7是影响肌肉损伤后肌卫星细胞增殖分化的关键因子，它能维持活化后肌卫星细胞的增殖水平并保持其自我更新潜能。增殖结束后，部分肌卫星细胞表达MyoD使增殖周期终止，促进肌卫星细胞分化为成肌细胞，MyoD表达的升高表明肌卫星细胞进入活化及分化阶段。MyoG能够调节肌管的终末分化，在细胞分化结束后，新生肌管中表达MyHC，形成成熟肌管，发挥骨骼肌纤维的生理功能。在骨骼肌发育和再生过程中，肌管细胞质中的MyHC标志着肌纤维再生，其表达强度用于评估肌纤维再生水平。本研究结果表明电针干预能有效上调大鼠损伤多裂肌中Pax7、MyoD、MyoG及MyHC的表达，而在针刺穴位局部使用外泌体抑制剂后，其表达水平显著下降，说明电针“委中”“肾俞”可以促进肌卫星细胞的增殖和成肌分化，缩短肌肉再生的过程，而拮抗穴区外泌体释放会降低针刺疗效。研究表明，外泌体可能是穴位发挥作用的关键物质基础，抑制穴区外泌体释放可降低针刺的疗效。也有学者认为针刺作为一种侵入性物理刺激在刺激穴位后，穴位局部纤维组织缠绕、断裂，损伤相关因子释放，激活相应细胞，从而释放外泌体，激活穴位初始动力学小网络——启动子，使针刺信息在穴位局部启动并级联放大，并通过激活神经-内分泌-免疫系统大网络，进一步经多层次、多系统将效应信息输出到靶器官。此外，外泌体中含有多种生物信息分子可以调控肌肉损伤后的再生修复。研究显示，损伤的肌纤维可以自分泌富含肌原性生长因子的外泌体进行修复。骨骼肌细胞分泌的外泌体会富集微小RNA（miR）-1、miR-133a、miR-133b和miR-206 4种肌肉特异性miRNA，这些由肌肉组织产生释放的外泌体运载至邻近组织的肌卫星细胞，通过负调控肌卫星细胞Pax7基因的表达、调节MyoG的表达，促进肌肉分化和肌纤维的再生，或通过进入血液循环传递至远处组织，实现远端肌肉组织之间的通讯。同时，其他细胞来源的外泌体也能够富集miR-125b等，作用于肌卫星细胞和成肌细胞，使MyoD和MyoG的表达增加，调控肌肉的增殖和分化，促进损伤肌肉的再生修复。因此，我们认为电针促进损伤肌肉再生修复的作用可能是通过外泌体进行介导，但外泌体中具体的介导物质仍需要进一步研究。此外，本研究穴区局部注射外泌体抑制剂后，抑制剂组相关蛋白的表达甚至低于正常组和模型组，可能是因为穴区局部注射GW4869不仅降低了电针对外泌体的促释放效应，同时降低了局部非损伤组织（如肌肉、脂肪等）外泌体的正常释放。研究表明，肌肉损伤后，局部非损伤组织外泌体的释放对肌肉再生修复同样具有重要的作用。