姜黄素+外泌体=双Buff？Stem Cell Res Ther｜西安交大第一附属医

湾湾今天分享的是一篇发表在【Stem Cell Res Ther】（IF：7.3）上题为“Curcumin pretreatment enhances the capacity of BMSCs exosomes to attenuate renal ischemia-reperfusion injury by ferroptosis suppression via miR-16-5p/Smad3/Mb axis”的研究，该研究通过体内外实验，结合转录组学等多技术，发现姜黄素预处理的外泌体（cur-exo）可增强对受损肾脏的靶向性，通过下调脂质过氧化、改善铁过载及恢复线粒体结构抗铁死亡。机制上，姜黄素通过调控CYP1B1升高cur-exo中miR-16-5p，其靶向Smad3 3'UTR抑制其翻译，下调Mb转录活性。该研究证实cur-exo通过miR-16-5p/Smad3/Mb轴治疗RIRI，为增强外泌体功能及RIRI治疗提供了新策略与靶点。

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流式细胞术检测。结果显示，分离的BMSCs高表达阳性标志物CD29、CD44、CD90、CD105，低表达阴性标志物CD34、CD45，符合BMSCs表型特征。

活/死细胞染色。结果显示，20 μM姜黄素处理组BMSCs死亡细胞显著增多。

CCK-8检测。结果显示，10 μM姜黄素对BMSCs无明显细胞毒性，且能维持细胞活力，确定为最优预处理浓度。

外泌体提取流程图。

透射电镜（TEM）检测。结果显示，exo和cur-exo均呈典型杯状或单侧凹陷半球形结构，直径约100 nm。

纳米颗粒追踪分析（NTA）。结果显示，exo和cur-exo粒径分布在50-150 nm，符合外泌体尺寸特征。

Western blot检测。结果显示，exo和cur-exo均表达外泌体标志物CD63、CD9、TSG101，不表达阴性标志物APOB。

这些结果表明，成功分离鉴定出高纯度BMSCs，筛选出10 μM为姜黄素预处理的最优浓度，且通过超速离心获得了符合标准的BMSCs exo和cur-exo。

生物发光成像（BLI）。结果显示，DiD标记的cur-exo在RIRI小鼠肾脏的荧光强度显著高于exo，且在4-96h内持续富集，靶向性更强。

免疫荧光染色。结果显示，Dil标记的exo和cur-exo均能与AQP1标记的肾小管上皮细胞共定位，cur-exo的共定位信号更显著。

血清生化检测。结果显示，cur-exo组小鼠血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平显著低于exo组，肾功能恢复更明显。

HE、PAS染色及KIM-1免疫荧光。结果显示，RIRI组肾小管结构紊乱、刷状缘丢失，exo和cur-exo均能改善损伤，cur-exo组肾小管结构更完整，KIM-1阳性信号显著降低。

Paller评分。结果显示，cur-exo组肾小管损伤评分显著低于exo组，组织损伤程度更轻。

KIM-1荧光强度定量。结果显示，cur-exo组KIM-1表达水平显著低于exo组。

肾组织检测。结果显示，cur-exo组Fe²+含量和丙二醛（MDA）水平显著低于exo组，铁过载和脂质过氧化程度减轻。

GPX4免疫荧光及定量。结果显示，cur-exo组GPX4阳性信号显著高于exo组，铁死亡抑制效果更优。

这些结果表明，姜黄素预处理增强了BMSCs外泌体对损伤肾脏的靶向性，能更有效地改善RIRI小鼠的肾功能，减轻肾小管损伤，其机制与抑制铁死亡相关。

对TCMK-1细胞摄取外源物和修饰外源物的过程进行流式细胞术分析。结果显示，TCMK-1细胞对DiO标记的exo和cur-exo的摄取呈浓度依赖性，相同浓度下摄取效率无显著差异。

共聚焦显微镜观察结果。结果显示，Dil标记的exo和cur-exo均能被TCMK-1细胞摄取，定位于细胞质或核周。

CCK-8检测erastin诱导TCMK-1细胞发生铁死亡的半数抑制浓度（IC50）值。结果显示，erastin诱导TCMK-1细胞铁死亡的IC50为5 μM。

CCK-8检测确定exo/cur-exo的最佳浓度，以减轻TCMK-1细胞的死亡。结果显示，40 μg/mL exo和cur-exo均能提高erastin诱导的TCMK-1细胞活力，cur-exo的保护效果更显著。

细胞内检测。结果显示，cur-exo组Fe²+含量、MDA水平显著低于exo组，GSH浓度显著高于exo组，铁过载和脂质过氧化得到更好改善。

qRT-PCR和Western blot检测。结果显示，cur-exo组ACSL4表达显著下调，GPX4、SLC7A11表达显著上调，铁死亡相关分子调控更明显。

TEM检测。结果显示，erastin组TCMK-1细胞线粒体皱缩、嵴消失，cur-exo组线粒体形态基本恢复，优于exo组。

流式细胞术定量分析ROS阳性细胞百分比，荧光成像显示TCMK1细胞内的ROS水平。结果显示，cur-exo组ROS阳性细胞比例显著低于exo组，氧化应激水平更低。

这些结果表明，cur-exo在体外可被肾小管上皮细胞（TCMK-1）高效摄取，通过减轻铁过载、脂质过氧化和氧化应激，恢复线粒体结构，显著抑制erastin诱导的铁死亡，且效果优于未预处理exo。

图4A-B：RNA-seq分析。结果显示，与Era+exo组相比，Era+cur-exo组有32个差异表达基因，其中Mb表达显著下调。

图4C：GO富集分析。结果显示，差异基因主要参与缺氧应答、氧化还原酶活性负调控等生物学过程。

图4D-E：TCMK-1细胞中Mb mRNA表达的qRT-PCR和Western blot验证。结果显示，erastin诱导后TCMK-1细胞Mb表达显著升高，cur-exo处理后Mb表达显著下调，且效果优于exo。

图4F-G：小鼠肾脏组织中Mb蛋白表达的Western blot和免疫荧光。结果显示，RIRI小鼠肾组织Mb表达显著升高，cur-exo处理后Mb表达显著下调，优于exo组。

图4H：qRT-PCR检测Mb过表达质粒转染效率。结果显示，Mb过表达质粒转染后，TCMK-1细胞Mb mRNA水平显著升高。

图4I-J：Western blot检测TCMK-1细胞中Mb、ACSL4、GPX4和SLC7A11表达水平。结果显示，Mb过表达后，cur-exo仍能下调ACSL4，上调GPX4和SLC7A11。

图4K-M：TCMK-1细胞中铁离子含量的测量与MDA水平的评估。结果显示，Mb过表达组Fe²+含量、MDA水平显著升高，GSH浓度降低，cur-exo处理后可逆转该效应。

图4N：TEM观察Mb过表达后TCMK-1细胞的线粒体形态变化。结果显示，Mb过表达后TCMK-1细胞线粒体损伤加重，cur-exo处理后线粒体形态显著改善。

图4O：Mb siRNA转染效率的qRT-PCR验证。结果显示，Mb siRNA转染后，TCMK-1细胞Mb mRNA水平显著降低。

图4P-Q：TCMK-1细胞中Mb、ACSL4、GPX4和SLC7A11表达的Western blot。结果显示，Mb敲低后，cur-exo进一步下调ACSL4，上调GPX4和SLC7A11。

图4R-T：TCMK-1细胞中的Fe2+含量分析、MDA水平评估与GSH浓度的测量。结果显示，Mb敲低组Fe²+含量、MDA水平显著降低，GSH浓度升高，cur-exo处理后效应增强。

图4U：TEM观察Mb敲低后TCMK-1细胞的线粒体形态变化。结果显示，Mb敲低后TCMK-1细胞线粒体损伤减轻，cur-exo处理后线粒体形态更接近正常。

这些结果表明，Mb是cur-exo抑制铁死亡的关键靶分子，cur-exo通过下调Mb表达，改善铁代谢和氧化应激，保护线粒体功能，从而发挥抗铁死亡作用。

图5A：生物信息学分析（hTFtarget、GTRD、PROMO数据库）。结果显示，Smad3是Mb的潜在转录因子。

图5B：AlphaFold3预测。结果显示，Smad3蛋白可与Mb启动子区域结合。

图5C-D：qRT-PCR检测。结果显示，Smad3 siRNA转染后，TCMK-1细胞Smad3 mRNA水平显著降低，Mb mRNA水平同步显著下调。

图5E：Western blot检测转染后Smad3和Mb蛋白的表达情况。结果显示，Smad3敲低后，Smad3和Mb蛋白表达均显著降低。

图5F-G：Western blot和免疫荧光检测小鼠肾脏组织中Smad3蛋白的表达情况。结果显示，RIRI小鼠肾组织Smad3表达显著升高，cur-exo处理后Smad3表达显著下调，与Mb表达趋势一致。

图5H：JASPAR数据库预测。结果显示，Smad3的DNA结合基序（5’-GTCTAGAC-3’）位于Mb启动子区域。

图5I：双荧光素酶报告实验。结果显示，过表达Smad3可显著激活Mb启动子的荧光活性，删除Smad3结合位点后（Mb mut），激活效应消失。

图5J -L：ChIP-PCR和ChIP-qPCR检测。结果显示，Smad3可特异性结合Mb启动子的5’-CACAGCAGG-3’区域，结合信号显著高于IgG对照组。

这些结果表明，Smad3可通过直接结合Mb启动子区域，在转录水平正向调控Mb表达，cur-exo可能通过抑制Smad3进而下调Mb。

通过TargetScan、miRWalk等4个数据库生物信息学分析。结果显示，11个miRNA可能靶向Smad3。

qRT-PCR分析exo与cur-exo之间miR表达的差异。结果显示，cur-exo中miR-16-5p表达显著高于exo，且TCMK-1细胞经cur-exo处理后，胞内miR-16-5p水平显著升高。

TCMK-1细胞检测。结果显示，敲低cur-exo中的miR-16-5p（cur-exo-miR-16-5pKD）后，Fe²+含量、MDA水平显著升高，GSH浓度降低，ACSL4表达上调，GPX4和SLC7A11表达下调，cur-exo的抗铁死亡效果消失。

转染后TCMK-1细胞检测。结果显示，miR-16-5p mimic可显著降低erastin诱导的Fe²+含量、MDA水平，升高GSH浓度，下调ACSL4，上调GPX4、SLC7A11和Mb；miR-16-5p抑制剂则呈现相反效应。

流式细胞术分析。结果显示，miR-16-5p mimic可降低ROS阳性细胞比例，抑制剂则升高。

免疫荧光检测。结果显示，miR-16-5p mimic可升高SLC7A11荧光强度，抑制剂则降低。

qRT-PCR和Western blot检测Smad3 mRNA与蛋白水平。结果显示，miR-16-5p mimic可显著降低Smad3的mRNA和蛋白水平，抑制剂则显著升高。

TargetScan预测。结果显示，miR-16-5p与Smad3的3’-UTR存在结合序列（5’-UGCUGCU-3’）；双荧光素酶报告实验显示，miR-16-5p mimic可显著抑制Smad3 WT载体的荧光活性，对Smad3 MUT载体无影响。

这些结果表明，miR-16-5p是cur-exo中的关键功能分子，通过直接靶向Smad3的3’-UTR抑制其表达，进而下调Mb，介导抗铁死亡效应。

生物信息学分析（SwissTargetPrediction等3个数据库）。结果显示，CYP1B1是姜黄素的潜在靶蛋白。

分子对接。结果显示，姜黄素与CYP1B1结合亲和力强，S值为-10.1359，存在稳定相互作用。

表面等离子体共振（SPR）验证。结果显示，姜黄素与CYP1B1结合特异性高。

CHX追踪实验。结果显示，10 μM姜黄素可显著延长CYP1B1蛋白的半衰期，延缓其降解。

qRT-PCR验证转染效率。结果显示，CYP1B1 siRNA转染后，BMSCs中CYP1B1 mRNA水平显著降低。

EdU染色。结果显示，CYP1B1敲低后BMSCs增殖率降低，姜黄素处理可挽救该效应。

qRT-PCR检测CYP1B1敲低后BMSCs中miR-16-5p表达。结果显示，miR-16-5p表达显著降低，姜黄素处理可逆转该趋势。

Western blot。结果显示，CYP1B1敲低后，BMSCs中Exportin-5（pre-miRNA核质转运关键分子）表达显著降低，姜黄素处理可缓解该下调。

Co-IP实验。结果显示，CYP1B1可与Exportin-5特异性相互作用。

qRT-PCR检测Exportin-5敲低后，BMSCs中miR-16-5p表达。结果显示，miR-16-5p表达显著降低，姜黄素处理可挽救。

这些结果表明，姜黄素通过与CYP1B1结合并延长其蛋白半衰期，促进CYP1B1与Exportin-5相互作用，增强miR-16-5p在BMSCs中的表达，进而提高cur-exo中miR-16-5p的含量。

该研究证实了cur-exo对损伤肾脏的靶向性，可显著缓解RIRI，核心机制为姜黄素稳定CYP1B1并促进其与Exportin-5相互作用，升高BMSC中miR-16-5p；cur-exo递送该miR至肾小管上皮细胞，靶向Smad33’-UTR并抑制其表达，转录水平下调Mb，最终通过减轻铁过载、脂质过氧化及氧化应激、恢复线粒体功能，抑制铁死亡实现肾脏保护。