综述| 外泌体检测在骨肿瘤诊疗中的研究进展

肿瘤的病理学检查结果对临床诊断及治疗有非常重要的意义，取得肿瘤组织标本除了手术以外，穿刺组织活检是目前临床的主要方法。穿刺活检存在有创操作、患者疼痛、穿刺未达到病变部位以及不易重复取材的问题，影响疾病的诊疗。液体活检克服了组织活检的缺点，为恶性肿瘤的诊断和预后评估提供了新的思路。肿瘤发生的早期就有肿瘤细胞或者肿瘤DNA片段释放到体液中，液体活检包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTCs）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）和外泌体检测［1-3］。这3类液体活检在肿瘤诊断和预后评估中都有较好的应用［4-6］。本文对外泌体检测在骨肿瘤诊疗中的研究进展综述如下。

外泌体的产生与胞外囊泡密切相关。按产生机制及大小的不同，胞外囊泡可以分为微囊、外泌体和凋亡小体。外泌体是一种囊泡状的物质，产生需要满足3个关键条件：（1）质膜内陷，产生内吞性的小泡。（2）早期核内体的出现。（3）晚期的多泡体（multivesicular bodies,MVBs）的出现。晚期MVBs的形态可由原来的管状逐渐转化为球形，在这个过程中MVBs与细胞内的溶酶体和质膜结合，导致它们溶解和吸收，以便把腔内的囊泡释放出来，有一部分囊泡状的物质就形成外泌体。人体组织多种细胞在正常及病理状态下均可分泌来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，只有30～100 nm的多囊泡体才称之为外泌体。外泌体中含有多种成分，包括蛋白质、脂质、DNA及其非编码RNA，在多种生命活动中起着关键作用，例如免疫反应、抗原提取、细胞间通信、蛋白质及RNA的传输［7-9］。外泌体可因细胞的微环境和固有的生物学特性受到外界环境的影响而改变，例如细菌的侵害、微生物的侵入或者其他压力而被释放出来。外泌体是一种纳米级胞外囊泡，可随体液交换移动，其广泛分布于人体内。随着检测方法更新，通过电子显微镜可以观察到外泌体的外层结构主要是由脂质双分子层构成，进一步检测发现其内包裹着DNA、mRNA、miRNA、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)以及多种蛋白质。肿瘤细胞产生的外泌体分布广泛、内容物多样，使其可以在人体内多种体液或分泌物中分离检测出来，为肿瘤的早期诊断提供了可能性。研究表明，肿瘤细胞产生的外泌体能够在人体内转移，并且在转移中产生多种蛋白质，因此，可以利用医学实验室技术（如实验室基因组学及蛋白质组学）来分析它们在肿瘤患者中的作用［10］。根据肿瘤细胞的外泌体特征可以准确地识别出外泌体由哪些细胞产生，还可以利用外泌体的靶向作用，使其成为靶向药物的载体，为肿瘤的靶向治疗提供了新路径［11］。外泌体在上皮组织来源的恶性肿瘤细胞的转移（主要有蔓延、淋巴、血行和种植4种途径）中发挥着重要作用［12］。间叶组织来源的恶性肿瘤（主要为骨肉瘤和尤文肉瘤）具有特异性，通过蛋白质组学分析证实，MG63、SAOS-2以及U2OS的骨肉瘤细胞分泌的外泌体中所含的蛋白质与恶性肿瘤分泌的蛋白质类似［13-14］。因此，这些蛋白质在临床中的应用潜力巨大。外泌体可由多种细胞类型分泌，大部分肿瘤在不同阶段释放外泌体的水平不同，而且分泌外泌体的内容物和功能亦不同。研究证实母体肿瘤细胞对外泌体内容物和功能有重要影响，外泌体在肿瘤形成和发展过程中起着重要作用。骨肉瘤细胞在增殖过程中会产生外泌体，它们可以改变肿瘤细胞的微环境，激活肿瘤相关信号通路、诱导免疫耐受、重塑细胞外基质及增强肿瘤细胞侵袭性来促进肿瘤的发生和发展，例如促进肿瘤的生长、转移和血管形成，并且可以有效地躲避宿主的免疫监测［15-16］。外泌体的分离和检测方法较多，效果良好，如超速离心、沉淀、超滤、免疫分离和尺寸排阻色谱法［17-18］。每种分离技术都有其优点，使用时应该结合实际情况综合考虑，从而确定最佳的分离和检测方法。外泌体分子结构内容物非常丰富，包含多种特殊成分，主要包括：（1）四分子交联体家族的主要组分CD49d和CD106。（2）miRNA。（3）酶类。（4）转录因子。（5）整合素。（6）胆固醇。（7）细胞骨架蛋白。（8）mRNA和DNA。（9）受体。（10）热休克蛋白。（11）病毒。外泌体与靶细胞之间的相互作用可以归结为3个方面：（1）外泌体表面上的功能性蛋白质可以与靶细胞相互作用，从而激活相关的信号转导机制。（2）外泌体可以与靶细胞之间的信息交互作用。（3）当蛋白受体与外泌体接触时，会启动内吞作用，将外泌体携带的生物信息完整地传递给靶细胞。在靶细胞基因的合成、转录以及翻译的全部环节［19］，肿瘤细胞会受到机体的反击，而这种反击的有效途径就是利用多种抗癌活性物质，这些物质能够有效地增加机体的抗肿瘤能力，从而阻碍肿瘤的进展。研究表明，肿瘤性外泌体能够分泌多种免疫抑制分子，主要有FasL、白细胞介素（interleukin,IL）-10、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)以及前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)等［20］。这些物质能够减弱人体对肿瘤的免疫识别与应答。

传统的血液学检查可能无法准确反映出间叶组织来源的恶性肿瘤，但是通过应用外泌体检测，能够有效地判断病变的发展，从而更好地改善疾病的预后。研究表明，骨肉瘤的可溶性蛋白、RNA、miRNA以及与之有关的蛋白质都能够在骨肉瘤的外泌体中发现，且能促进骨肉瘤的侵犯、迁移以及毛细血管的形成，这些蛋白质的存在能更好地预防骨肉瘤的发展［23］。研究证实，骨肉瘤外泌体分泌的蛋白质与传统的上皮性恶性肿瘤分泌的蛋白质之间存在差异［24］。母体肿瘤细胞的侵袭能力及其在远距离的传播能力都得到了143B细胞的支持，而HOS细胞的侵袭能力则不及143B。此外，143B细胞的外泌体也具有大量与破坏骨骼结构有关的基因。研究发现，RANKL的表达对于转移瘤及其他骨肿瘤十分重要，抗RANKL的单克隆抗体（迪诺单抗）通过直接与成骨细胞表面的RANKL结合产生复合物，能够抑制破骨前体细胞与RANKL结合，进一步减少破骨前体细胞产生，导致骨肿瘤的融骨破坏减弱，进而阻止肿瘤的发展［25］。Branstetter等［26］的研究证实，RANKL在骨肉瘤细胞中的表达率差别较大，高的达到68%，低的仅占9%［27］。因此，在骨肉瘤细胞中RANKL的表达水平与肿瘤发展的关系还需要更多的研究来证实。研究发现，骨肉瘤源性外泌体具有抑制细胞生长、激活细胞的作用，还可促进相关细胞因子的产生，如热休克蛋白的合成，这些因素都会对人的免疫系统产生重要的作用，有助于防止肿瘤细胞的扩散［28-30］。肿瘤源性外泌体可通过多种方式检测出来，成为检测肿瘤的重要方法。miR-25-3p的测定结果对预测骨肉瘤患者的预后具有价值［31］。一项研究显示，14例骨肉瘤、14例非骨肉瘤以及8例骨肉瘤康复患者的血清miR-25-3p含量均不一样，骨肉瘤患者血清miR-25-3p的含量远超其他组别［32］。从骨肉瘤细胞系SAOS-2、HOS、U2OS以及143B的细胞悬液中，也能够检测出相对较高的miR-25-3p含量。因此，血清miR-25-3p的含量高低可以作为骨肉瘤诊断的相关指标［12］。骨肉瘤细胞的外泌体、囊泡以及凋亡小体都含有尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase plasminogen activator,uPA），其中转移型骨肉瘤细胞uPA的表达量比非转移型高出许多，而在骨肉瘤细胞的胞质中uPA含量比细胞悬液中的外泌体明显低，表明uPA水平高低在骨肉瘤转移中有一定的研究价值。研究结果显示，uPA/受体对于改变骨肉瘤患者的临床表型具有重要的影响，而这种影响的机制则是由于它们的外泌体介导的旁分泌及自分泌机制所致［33-34］。这种肿瘤的形成和发展与外泌体的功能密切相关。

随着医学的发展，外泌体的生物学特性研究越来越深入，特别是在骨与软组织肿瘤领域，通过基因组学、蛋白质组学等高通量检测技术，可以准确地识别骨肿瘤细胞膜表面上的蛋白分子，更清楚地了解骨肿瘤患者体液中的外泌体，以及它们与正常人群之间的表达差异，从而为疾病的诊断和预后的评估提供重要的参考依据。通过蛋白质组学技术，可以从外泌体表面提取出具有特定功能的蛋白质。通过识别和评估从外源基因组获取的基因，能够更好地区分出正常和恶化的基因组。这种基因组的优势之一就是它们能够有效地向靶向的器官传递信息。在肿瘤形成的各阶段均可以产生外泌体，从血液或其他体液分离出的肿瘤中过度表达蛋白质并不一定具有肿瘤特异性，非肿瘤组织也能产生相同的标志物，并在正常人体内产生不同数量的标志物。通过用组织特异性(或肿瘤特异性)标志物富集外泌体，可以获得更高的灵敏度和特异度。外泌体作为骨与软组织肿瘤诊断标志物的优点：（1）性质比较稳定，广泛存在于人体体液中。（2）肿瘤外泌体特异度高有利于肿瘤的诊断及鉴别诊断。（3）相对容易取得，创伤小，患者容易接受。（4）肿瘤外泌体标志物提取技术成熟，纯度高、易收集和储存。相较于传统的组织活检，基于外泌体的液体活检具有更高的应用价值。外泌体检测既可以检测出上皮细胞所致的肿瘤，也可以检测出特异度较高的间叶组织所致的肿瘤，其在骨与软组织肿瘤的诊断、预测以及治疗方面都具有较高的价值和应用前景。