智荟智选 | 外泌体工艺干货深度解析
外泌体（Exosome）作为细胞外囊泡的一种，正在成为生命科学和生物医药领域的研究热点。它不仅是细胞间沟通的“信使”，更在疾病诊断、药物递送和精准治疗中展现出巨大潜力。今天，我们带您深入了解外泌体的定义、应用、工艺开发及未来趋势，并介绍Cytiva相关产品在外泌体工艺开发中的应用。
一、
外泌体属于细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EV）的一类，尺寸通常小于200 nm（一般直径30-150 nm），来源于细胞分泌。外泌体在中性条件下一般携带负电荷，表面含有糖蛋白、抗原。它们携带的蛋白质、脂质、核酸等多种生物分子，能够在细胞间传递信息，调控生理和病理过程。
二、
外泌体在医学领域的应用主要集中在两个方向：
01
疾病诊断
外泌体中包含丰富的生物标志物，如miRNA、蛋白质等，可用于早期疾病检测，尤其在肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病等方面具有重要意义。
02
治疗与药物递送
外泌体天然具备良好的生物相容性和低免疫原性，能够作为药物载体，将治疗分子精准递送至靶细胞，推动个性化医疗的发展。
三、
外泌体的产业化应用面临诸多挑战，尤其在细胞培养、纯化和规模化生产等方面。针对以上问题，本文将具体介绍Cytiva在外泌体获取过程中细胞培养，纯化和过滤相关步骤的工艺策略，以及可以提供的相关产品。
01
细胞培养策略
外泌体的来源主要是细胞培养，因此培养工艺至关重要。目前外泌体表达的细胞多为间充质干细胞 (MSC)、骨髓干细胞、HEK293等。其生产工艺的主要挑战在于外泌体上游的产量低，某些细胞类型传代次数限制，培养难度较大。针对不同的细胞类型，Cytiva推出不同的细胞培养方案。
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贴壁型细胞
推荐使用Cytodex1微载体，Cytodex1为葡聚糖基架（不含有动物源成分）几乎适合所有贴壁细胞；如果不需要进行细胞回收，可以使用Cytopore 2微载体。微载体的关键参数是表面积，直接影响外泌体产量。
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微载体参数 |
Cytodex1 |
Cytopore2 |
|
密度（g/ml） |
1.03 |
1.03 |
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平均直径（ µm） |
190 |
235 |
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数量（个/g干重） |
4.3 X 106 |
3.0 X 106 |
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表面积 （cm2/g干重） |
4400 |
11000 |
|
膨胀因子 （ml/g干重） |
20 |
40 |
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沉降系数 （cm/min） |
12-16 |
13-19 |
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平均气孔孔径 （ µm） |
无气孔 |
30 |
贴壁细胞的另一种培养方法是通过固定床3D贴壁培养，固定床生物反应器（iCellis）是为贴壁细胞提供极佳生长条件的一种自动化、一次性的生物反应器系统，具有以下特点：
全集成式一次性生物反应器，预安装校准探头于一体。
与传统搅拌罐相比，高细胞密度固定床生物反应器结构紧凑，可显著增加容积生产率。
与传统2D器皿相比，大大降低运行成本和资本投入。
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悬浮细胞
针对HEK 293无血清悬浮培养工艺，建议使用Hyclone Prime 悬浮培养基外加细胞补料Cell Boost 7a/7b，适用于提高细胞密度与外泌体产量，满足大规模外泌体生产的需求。
02
外泌体纯化方法
目前常用的纯化技术包括：
密度梯度离心：经典方法，纯度高，但是离心的方法操作复杂、耗时较长。
膜过滤技术：平板膜包（100 KDa或300 KDa）、中空纤维（500 KDa或750 KDa），适合不同纯度要求。
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层析技术
推荐使用填料如Capto Core 700/400，其特点是载量高、流速快，易于放大，适用于外泌体纯化下游工艺。除了使用Capto core填料还可以尝试使用Capto Q ImpRes/Capto adhere/Capto DEAE作为备选的层析步骤填料。
03
澄清与除菌
外泌体纯化过程中澄清过滤和除菌过滤步骤：澄清过滤步骤可以使用PDK11/PDH4/PDP8深层过滤滤器；除菌过滤步骤推荐使用EKV/ECV/EDF除菌滤器。
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滤器代码 |
上层滤材 |
下层滤材 |
应用特点 |
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PDK11 |
K900P（8–20 µm） |
V100P （2–4 µm） |
同时抓大颗粒 + 小细胞碎片；强力澄清 |
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PDH4 |
K700P（6–15 µm） |
KS50P （0.4–0.8µm） |
更高澄清度 适中载量 |
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PDP8 |
T1500P （约 11–30 µm） |
K700P （6–15 µm） |
高通量、截留粗颗粒 |
澄清步骤中对于贴壁细胞样品，其浊度低可以直接使用预过滤器进行澄清，这样外泌体的收率会有比较不错的保证；悬浮培养样品浊度相对较高推荐两级深层过滤，单级可能浊度控制不住或者载量太低。
除菌过滤方面， EKV除菌级滤器，被广泛用于生物制药工艺中的最终过滤、培养基除菌和工艺液体的除菌过滤。ECV除菌过滤器具有超高流速和高通量的特点，可以高效过滤高污浊高粘度料液。EDF除菌滤器，适用于复杂液体的终端除菌过滤如脂质纳米颗粒（LNP）、高粘度抗体制剂或者含微粒、沉淀或易沉积组分的溶液。
四、
随着技术进步，外泌体将在精准医疗，液体活检和再生医学等多个领域发挥更大作用：因此外泌体有望成为生物医药产业的重要组成部分，推动创新药物开发和个性化治疗。
