开年重磅！90分综述详解外泌体靶向与摄取：从基础到临床转化-上
法国科学家Guillaume van Niel在外泌体的起源、分泌机制及病症关联的研究中做出了重大贡献，并发展了外泌体的成像技术。Guillaume van Niel团队2026新年巨作—90分综述，聚焦于EV与受体细胞相互作用及EV胞内命运背后的细胞生物学机制，探讨EV实现细胞特异性靶向、细胞信号传导及功能性货物递送的机制，同时列举当前限制EV成为高效治疗性纳米载体的核心挑战。还探究了：深入理解EV与受体细胞相互作用的分子机制及其相关功能，如何将EV应用于治疗策略提供新的思路。
细胞外囊泡（EV）是几乎所有细胞类型都会释放的磷脂双分子层脂质包裹颗粒，可携带多种生物分子，包括蛋白质、脂质与核酸。这些货物分子能被受体细胞利用，通过诱导受体细胞的表型变化，EV在生理与病理过程中发挥关键作用。EV能够包裹活性物质并保护其免于降解，这一特性使其成为极具潜力的治疗递送纳米载体；经工程改造的EV相比传统载体具有更强的效能，且与脂质纳米颗粒（LNP）等合成载体相比，体内耐受性更佳。不过，这些优势会因生物学背景与所用的具体工程策略而有所差异。
EV的亚型与异质性：EV的亚型与异质性：按生物发生/尺寸分为外泌体、微囊泡等亚型；异质性（尺寸、组成等）是其研究与应用的核心挑战，分离技术难以富集特定亚群。
EV的作用方式：通过旁分泌/内分泌等方式作用于邻近/远端细胞，既参与生理病理过程，也决定了其作为载体的作用范围。
本综述聚焦EV生物学的后期阶段，即EV与受体细胞的相互作用、摄取机制、货物递送及胞内命运，而不涉及EV生物发生与释放等前期环节。首先概述参与促进EV与受体细胞相互作用、介导信号通路的EV货物；随后探讨EV摄取的不同机制与货物递送过程；最后探究EV在溶酶体中的胞内命运，并阐述将EV转化为高效治疗纳米载体面临的挑战与机遇。
EV携带多种生物分子，包括脂质、蛋白质、核酸与代谢物。EV的组成反映了供体细胞的生理或病理状态，且在一定程度上会因EV亚型及生物发生的分子机制不同而存在差异。本节中，依据定位对EV货物进行分类（从外向内），重点关注与EV靶向、信号传导、摄取及功能相关的货物。
2.1 囊泡外货物与生物分子冠
EV的表面是其与细胞外环境的主要界面，对EV的锚定及后续内化起关键作用。EV释放后，会从细胞外环境中获得一层动态的生物分子包被，统称为“生物分子冠”。该概念最初发现于浸泡在生物体液中的合成纳米颗粒表面，如今EV表面的生物分子冠也逐渐得到认可。近期研究表明，EV会从周围微环境中吸附多种蛋白质、脂质与核酸，而这种生物分子冠会影响EV的生物学身份与功能。
构成生物分子冠的外周膜蛋白，通过巯基依赖的相互作用、静电相互作用，或与糖基化的EV膜相关蛋白结合，从而与EV膜关联。值得注意的是，纤连蛋白、白蛋白、免疫球蛋白、补体因子C1q与蛋白聚糖等蛋白，是EV冠中常见的组分。这些分子最初被视为污染物，如今已被认定为功能性成分，会显著影响EV的生物分布、摄取与功能。冠的形成具有动态性与环境依赖性，其组成会因EV群体与生物体液的不同而变化。此外，多数冠形成于细胞外，但部分组分在EV生物发生过程中就已获得。
EV携带丰富的膜蛋白，包括跨膜蛋白与膜相关货物，这些分子决定或抑制EV与特定受体细胞的相互作用。整合素、细胞间黏附分子（ICAM）等黏附分子，在EV靶向、受体细胞摄取及下游信号传导中起关键作用。例如，肿瘤来源EV上的ICAM-1与活化T细胞表面的整合素α-L（LFA-1）相互作用，会对T细胞产生免疫抑制效应。其他膜相关蛋白（如白细胞表面抗原CD47）则作为“别吃我”信号，抑制巨噬细胞的吞噬功能，从而延长EV的循环时间、提高其到达靶细胞的概率。EV表面还存在糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白（可防止EV在细胞外环境中降解）与分子伴侣蛋白（可能通过与CD91的相互作用促进EV与受体细胞的结合）。这些蛋白在EV与靶细胞结合中的作用，主要取决于它们在囊泡表面的富集程度；此外，还需考虑其囊泡外结构域的大小—整合素、蛋白聚糖等较大的囊泡外结构域，有助于EV与受体细胞表面的初始接触。
这些蛋白锚定或插入EV的脂质双分子层膜中，而EV膜的组成具有特异性，胆固醇、鞘磷脂、糖鞘脂、磷脂酰乙醇胺与磷脂酰丝氨酸的富集程度会因供体细胞类型与EV亚型而异。除了在EV膜中起结构性作用（如促进受体聚集），脂质还参与蛋白分选、膜出芽，以及调控受体细胞对EV的摄取。例如，EV表面的磷脂酰丝氨酸可介导内皮细胞、巨噬细胞或树突状细胞对EV的摄取，这可能是通过与磷脂酰丝氨酸受体（T细胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白4，TIM-4）结合，或招募膜联蛋白A5至EV表面实现的。相反，四跨膜蛋白（如CD63、CD9、CD81）与支架蛋白（如flotillin）等膜相关蛋白，已被证明可与胆固醇相互作用，促进EV膜中胆固醇的富集。尽管具体机制尚不明确，但这种胆固醇富集会影响EV的生物发生、cargo分选，以及EV在受体细胞中的功能。
EV的腔内含多种生物分子，这些分子或被动、或主动地被分选到EV中，参与EV介导的信号传导。从信号传导能力来看，最重要的腔内cargo包括核酸、蛋白质与代谢物。mRNA、微小RNA（miRNA）、其他非编码RNA与DNA已在EV中被广泛报道；但也有研究对其腔内定位提出质疑，认为可能是游离核酸或脂蛋白结合核酸的污染，并挑战了其功能相关性。EV还携带代谢物（如腺苷、ATP、cAMP），这些分子可能参与EV介导的信号传导。此外，腔内蛋白cargo（如内体分选复合物ESCRT亚基、自噬标志物微管相关蛋白1A/1B轻链3（LC3）、ALG-2相互作用蛋白X（ALIX））反映了EV的生物发生与细胞内分选机制。利用这些分选机制，在EV生物发生过程中特异性整合治疗性货物，为设计EV作为治疗载体提供了新的装载策略。
EV释放后，既能与邻近细胞发生局部相互作用，也能作用于远端器官与组织。在到达靶细胞之前，EV需要穿过复杂的环境并克服多种物理屏障：局部环境中，EV会与细胞外基质（ECM）及细胞周围富含蛋白聚糖的周围细胞基质相互作用；而循环中的EV则需穿过血管内皮等生物屏障，避开清除机制并在血液及其他生物体液中穿梭，最终抵达远端组织。这些屏障如同选择性过滤器，塑造了EV的生物分布与特异性。本文将聚焦EV与受体细胞的结合及摄取机制。
EV对受体细胞的结合具有选择性：例如，少突胶质细胞来源的EV会被小胶质细胞内化，但不会被星形胶质细胞或神经元内化；神经母细胞瘤来源的EV可广泛结合神经元与神经胶质细胞，而皮质神经元来源的EV仅选择性结合神经元。通过光镊技术观察单个EV与细胞的接触可发现，小胶质细胞来源的EV与小胶质细胞的结合模式，与其他细胞的结合模式存在明显差异。
在小鼠模型中，外源性给药的EV与内源性释放的EV主要在肝脏和脾脏中累积，也会在胃肠道和肺部有少量分布。巨噬细胞与肝脏库普弗细胞是EV的主要受体细胞，这与其在清除、免疫监视及代谢调控中的作用有关。因此，EV与受体细胞的结合，是特定配体-受体相互作用，以及EV在细胞外空间移动时与吞噬细胞随机相遇共同作用的结果。
EV的结合受EV固有因素与受体细胞固有因素的共同影响，包括表面蛋白、脂质，以及局部微环境。四跨膜蛋白通过与EV上的黏附蛋白相互作用，促成EV生物发生过程中这些蛋白的共分选，从而参与细胞类型特异性的调控。例如，TSPAN8在EV生物发生过程中招募血管细胞黏附分子1与整合素α4，增强EV与内皮细胞的锚定及摄取；而TSPAN15则促进EV与神经元的锚定。EV结合的ECM分子与整合素，会进一步调节EV的生物分布，并调控EV与细胞的结合及摄取。EV上的整合素还会促进EV在ECM中的滞留，进而被成纤维细胞摄取。除了蛋白-蛋白相互作用，蛋白-脂质相互作用也会介导EV的结合：例如，EV上的磷脂酰丝氨酸可与免疫细胞上的TIM-1及TIM-4受体结合，促进EV的内化。
EV的表面糖基化，反映了其来源细胞高尔基体中膜相关蛋白的糖基化状态，这对EV被受体细胞识别与内化起到关键作用。EV膜上展示的聚糖（尤其是末端唾液酸），可与受体细胞上的凝集素或ECM成分相互作用。例如，整合素的去唾液酸化会损害EV与纤连蛋白的结合能力，进而降低EV的摄取效率；此外，用糖苷酶处理EV会改变其生物分布，促进其在肺部的累积，或损害EV介导的T细胞活化等功能。相应地，受体细胞上蛋白的糖基化也会影响EV的锚定。细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）已被确定为EV的受体，可促进EV的内化；EV上的凝集素（如galectin-3与galectin-5）也可与这些蛋白聚糖结合，进而促进摄取。
此外，生物分子冠会影响EV的结合与/或摄取。富含免疫球蛋白的蛋白冠可通过补体因子增强单核细胞对EV的摄取；而富含白蛋白的冠则能通过与肝脏白蛋白受体结合，将囊泡从巨噬细胞重定向至肝细胞，从而影响EV向特定组织的靶向。
尽管部分EV会持续结合在受体细胞膜上，但EV要对受体细胞产生功能性影响，需先发生内化，随后释放内容物，被称为“EV摄取”的内化过程，需与“EV递送”区分开—后者通常指EV内容物转移至细胞质（无论EV本身是否内化，或内化后是否被后续处理）。已有充分证据证实EV能被细胞摄取，但调控这一过程的机制仍存在争议。本节将探讨与EV摄取相关的途径及分子因素。
受体细胞对EV的摄取是一个异质性过程，涉及多种内吞途径。研究报道了网格蛋白介导的内吞、小窝蛋白依赖的摄取、巨胞饮、吞噬作用及脂质筏介导的内吞等途径的参与，但哪种机制更普遍，目前尚未达成共识。摄取途径的多样性可能反映了EV亚群、受体细胞类型及实验条件的差异。例如，较小的EV相比较大的EV更易被优先内化，这很可能是通过网格蛋白或小窝蛋白介导的内吞途径实现的；而较大的囊泡可能依赖其他能适配其尺寸的内化途径。单一EV群体（即来自同一细胞的EV）可同时触发多种内化途径，由受体细胞类型与EV成分决定。
受体细胞与质膜的直接融合也被认为是EV进入细胞的一种机制，不过支持这一过程的证据仍然有限。融合更易在酸性条件下发生，且肿瘤酸性微环境等环境因素、细胞特异性特征等，都可能影响融合是否发生。例如，内吞能力较弱的细胞（如低胞饮性的脑内皮细胞）更可能通过膜融合而非内吞作用摄取EV；而巨噬细胞等吞噬细胞则主要依赖内吞途径。另一种被提出的机制基于肌动蛋白驱动的突起（如丝状伪足），这类结构已被证实是EV摄取的内吞热点区域。受体细胞膜的生物物理特性（如膜流动性、剪切力带来的限制）似乎也会调控EV摄取，这进一步增加了过程的复杂性。
这种摄取途径的明显异质性，也可能源于研究这些途径时存在的技术局限性。解析内吞途径的常用方法是使用药理学抑制剂，但这些化合物往往缺乏途径特异性，可能会干扰多种摄取途径，从而增加了数据解读的复杂性。此外，PKH家族等亲脂性荧光染料（以其发现者PaulKarlHoran命名）虽被广泛用于追踪EV内化，但它们会影响膜-膜融合及EV尺寸，可能干扰摄取过程，或形成聚集体导致非特异性信号的检测。这些方法学挑战凸显了在EV摄取研究中，需要设置恰当的对照并采用替代标记策略，以提高研究的准确性。
Box1|细胞外囊泡相互作用研究的技术局限性
EV与受体细胞相互作用的研究，本质上受限于EV自身的特性：它们尺寸微小、具有异质性，且分离与鉴定过程存在诸多挑战。这些因素会使实验结果的解读变得复杂，因此在评估EV的功能影响时，需考虑这些局限性。
与EV分离相关的局限性
EV相互作用研究的主要挑战之一，是难以获得纯的、亚型特异性的EV群体。现有方法往往无法富集特定亚群，导致制备物具有异质性。这一局限性尤为重要，因为不同EV亚群的递送效率存在差异，且会受所用分离方法的影响。EV亚群的区分基于尺寸、密度、表面标志物等重叠的特征，这使得确定其精确来源十分困难。目前尚无金标准分离方法，技术的选择取决于起始材料（如细胞培养物或生物体液）与预期的下游应用。研究者必须在产量、纯度与完整性之间进行权衡。
最常用的分离技术包括差速超速离心、密度梯度离心与体积排阻色谱，每种技术各有优劣：差速超速离心应用广泛，优势在于易获取且能回收大量EV，但该方法常导致可溶性蛋白、脂蛋白等污染物的共分离，且高剪切力易引发囊泡聚集、潜在的膜损伤；密度梯度离心可通过浮力密度分离囊泡，能获得最纯的EV制备物，但会造成EV的大量损失；体积排阻色谱是一种快速简便的技术，可根据尺寸高效分离EV与可溶性蛋白，具有较高的产量与可重复性，但可能无法去除高密度脂蛋白或其他类似尺寸的污染物。这些与分离相关的偏差，引发了人们对“观察到的生物学效应究竟是EV导致的，还是共分离成分导致的”这一问题的担忧。
与EV标记和追踪相关的局限性
EV分离后，其与受体细胞的相互作用可发生在多个层面（包括表面结合、内化、内容物递送）。这些相互作用的相对重要性尚不明确，因为多数研究假设功能效应仅来自EV内容物，但这一点尚未被明确证实。此外，多数用于评估EV摄取分子机制的研究，并未区分“表面结合”与“实际内化”。
可视化EV相互作用的主要方法依赖荧光标记：要么使用脂质或蛋白染料，要么对EV相关蛋白进行基因标记，随后通过显微镜或流式细胞术检测。脂质染料常被掺入EV膜以标记EV，但它们缺乏特异性，还可能使分离出的EV形成聚集体；这些染料也可能转移至受体细胞的膜上，导致并非真正反映EV转移的假阳性信号。此外，蛋白染料用于标记表面蛋白时，也可能标记游离蛋白与细胞外颗粒。这类标记染料的荧光信号持续时间较长，这是另一个局限性—它可能无法准确反映受体细胞中EV的数量。
基因标记策略（如将荧光蛋白与EV标记物融合）可实现活细胞成像中EV的追踪，但这类修饰可能影响EV的生物发生、货物装载与功能，因此需要使用未标记的EV作为对照，以评估潜在的人工伪像。
为应对这些挑战，研究EV相互作用时必须采用多种互补方法，包括使用不同的分离方法与标记策略，并仔细区分“表面结合的EV”与“内化的EV”。随着分离与检测技术的不断发展，克服这些局限性将是推进EV介导通讯研究的关键。
该领域的一个核心问题是：EV摄取是选择性的、由EV诱导的过程，还是非特异性事件？有证据表明，EV与受体细胞的结合频率较低，且大多是非特异性的。例如，巨胞饮是一种非选择性的摄取机制，其结果是细胞外液及其内容物被内化。不过，EV可能通过直接激活磷脂酰肌醇-3激酶通路等信号通路，主动触发巨胞饮的诱导，从而增强自身的内化。
越来越多的证据支持“EV摄取通常是受体介导的”这一观点，目前已鉴定出凝集素、黏附分子、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）及清道夫受体等多种蛋白作为EV内吞的介导因子。这些因子也会介导EV与受体细胞表面的结合，但目前尚不清楚它们主要参与EV的锚定、内化，还是两者兼具。例如，HSPGs通过与EV相关的凝集素及其他蛋白相互作用，充当EV的锚定平台。与病毒和细菌利用糖脂进行细胞附着的方式类似，这些相互作用可能通过诱导膜曲率、形成管状内吞小窝（不依赖网格蛋白机制）来促进EV内化。同样，HSPGs与整合素的协同作用会介导EV的结合，随后触发整合素介导的内吞，这将EV的锚定与内化过程关联起来，类似于病毒的入侵机制。
细胞表面的信号传导与EV摄取并非互斥，而是EV与受体细胞相互作用过程中可能存在的先后、相互依赖的事件。EV触发的信号传导已被证实可促进EV内化，这凸显了这些过程的关联性。EV可通过其表面的生物分子配体，在摄取后启动细胞内信号传导。
EV已被证实是多种信号通路的介导因子，包括Toll样受体（TLR）信号、受体酪氨酸激酶（RTK）信号、G蛋白偶联受体（GPCR）介导的信号，以及Wnt、Hedgehog、Notch、Eph-ephrin等其他信号通路。在疾病状态下（如细菌感染、癌症），细胞表面的TLR（尤其是TLR2和TLR4）会被EV激活。携带生物活性配体的EV可激活血管内皮生长因子受体等RTK，这些机制可能在病理环境中被利用。同样，肿瘤细胞释放的EV表面存在的PD-L1，可促进免疫耐受并阻止自身免疫，在黑色素瘤及其他癌症中，肿瘤来源EV上的PD-L1会在暴露于干扰素（IFN）后富集，并能与CD8⁺T细胞上的PD-1受体相互作用，从而抑制抗肿瘤免疫应答。
细胞增殖、迁移、干细胞维持、组织形态发生及神经模式形成等关键过程，也与EV介导的信号传导相关。例如，表面携带Hedgehog蛋白的EV已被证实可激活Hedgehog信号，促进细胞增殖并诱导癌症中的上皮-间质转化。携带脂化Wnt配体的EV可激活Wnt信号，这对胚胎发育与组织再生至关重要。Ephrin反向信号（即ephrin配体自身暴露后，与ephrin受体互作时产生的信号）已被发现参与肿瘤血管生成的诱导。
大量研究强调了EV结合的配体在激活靶细胞下游信号通路中的作用。EV的分泌也可能调控供体细胞自身的信号传导。例如，将受体和/或配体分泌到EV中，可能介导自分泌激活，或作为一种下调分泌细胞内信号的机制（尤其是在溶酶体降解受损的癌症等情况下）。在这类情况下，EV持续分泌受体或病毒受体模拟物，可能是清除这些受体、防止过度刺激的一种方式——这一点已在表皮生长因子受体变体Ⅲ、潜伏膜蛋白1及β-连环蛋白中得到证实。将受体分泌到EV中可促进可溶性配体从细胞外环境的清除，有效下调局部信号通路。体内受沙门氏菌刺激的巨噬细胞会释放转铁蛋白受体阳性的EV，这些EV会严重影响全身铁水平；它们被认为是体液应答的一部分，通过限制细菌生长（沙门氏菌的代谢、生长与毒力高度依赖于铁）来发挥作用。
细胞表面的信号传导与EV摄取并非互斥，而是EV与受体细胞相互作用过程中可能存在的先后、相互依赖的事件。有证据支持这一点：EV触发的信号传导已被证实可促进EV内化，这凸显了这些过程的关联性。此外，EV可通过其表面的生物分子配体，在摄取后启动细胞内信号传导。一个值得注意却常被忽视的机制是EV通过TLR进行的信号传导。TLR可定位于质膜（如TLR2、TLR4、TLR10）或内体（如TLR3、TLR7、TLR8、TLR9）。内体中的TLR会识别随EV货物进入内体的核酸，并诱导特定的信号通路，进而调控促炎基因的表达。实际上，肿瘤细胞来源的胞外囊泡（EVs）内携带的RNA分子，或在囊泡保持膜完整性被内吞后暴露于表面的RNA，可与免疫细胞中的Toll样受体（TLRs）结合，从而触发可能促进肿瘤生长与转移的免疫反应，这也凸显了EV相关TLR信号作为EV调控受体细胞基因表达的替代机制的作用。内化后的EV还与其他信号通路（如IFN、mTOR信号）的激活相关。
尽管质膜上的信号传导与内化后的信号传导并非互斥，但EV摄取在维持信号传导中的功能相关性仍是一个悬而未决的问题。内化的EV会迅速转运至溶酶体区室并在体外被降解，这表明EV摄取可能主要是为了终止EV诱导的信号传导。不过，这并不排除EV摄取也能延长信号传导的可能性，原因如下：首先体内注射的EV并非立即被转运至溶酶体途径，而是根据细胞类型的不同，滞留在非酸性区室中，这理论上可支持持续的内体信号传导；其次，由EV携带的细胞因子（如IFN-1）所维持的信号传导，此前被归因于下游信号分子的长半衰期，但实际上是由于IFN-1与其受体在Rab5阳性区室中滞留数天所致；第三，内体作为维持甚至增强下游信号传导的信号平台这一概念已得到证实，例如表皮生长因子与胰岛素受体信号通路。不过，这些结果可能存在偏差，因为这些EV通常是外源性添加的，且用量往往超过生理水平。
本篇综述很长，恩博没有做删减，但是非常值得大家仔细阅读。这篇综述是“EV研究的知识字典”，是“指导研究实践的操作手册”与“引领转化方向的战略地图”，是关注“细胞间通讯”“EV药物递送”“精准治疗”领域研究者的必读文献。
解读文献：
Ripoll L,Zickler A M,Vader P,El Andaloussi S,Verweij F J,van Niel G.Biology and therapeutic potential of extracellular vesicle targeting and uptake.Nat Rev Mol Cell Biol. Published online January 2,2026. doi:10.1038/s41580-025-00922-4
