外泌体——看这篇基本就够了!!!
外泌体（Exosome）特指直径在40-100 nm的盘状囊泡。最早于1983年由Harding等人和Pan等人分别在大鼠和绵羊网织红细胞中发现，并于1987年由Johnstone正式命名为“Exosome”。外泌体中包含多种物质如蛋白质、mRNA和microRNA，不仅能够用于疾病诊断以及病情监测，还能够用于细胞治疗、药物传递、医疗美容等领域，使得外泌体研究热度始终居高不下，有关外泌体研究的文章也成为Science、Nature等顶级期刊常客。
研究显示，所有类型细胞均可分泌外泌体，例如免疫细胞、上皮细胞、胚胎干细胞、间充质细胞和癌细胞等。外泌体形成过程为：首先，细胞膜内陷，杯状的早期分选内体（Early sorting endosome，ESE），ESE中主要包含保外蛋白、膜蛋白以及回收的外泌体；随后，ESE膜向内凹陷，并将胞质中的蛋白质、核酸和代谢物等包裹至ESE内部形成包裹由腔内囊泡的晚期分选内体（Lately sorting endosome，LSE）；最后，LSE成熟为多泡体（Multvesicular bodys，MVBs），部分MVBs通过与自噬体或者溶酶体融合发生降解，其他的MVBs则能够与质膜融合并释放腔内囊泡到细胞外，这些被释放到细胞外的腔内囊泡便是最终的外泌体。
✅整体外泌体膜蛋白
主要包括四次跨膜蛋白（CD81、CD82、CD37、CD63）及其伴侣蛋白（MHC II、IGSF8、ICAM-1、SDC1-4、Intergrins等）、膜信号蛋白（EGFR、c-Kit、GRCRs、Notch receptors、T cell receptors、cytokine receptors等）；
✅脂质锚定外膜蛋白
包括C端糖基磷脂酰基醇（GPI）锚定蛋白（CD39、CD73、Juno、CD55、CD59、glypican-1、PrPSC）以及Hedgehog形态发生素等；
✅脂质锚定内膜蛋白
包括酰化微小GTP酶（Rabs、Ras、Rho等）、肉豆蔻酰化信号激酶（Src）以及棕榈酰化膜蛋白等；
✅外周表面蛋白
包括Wnt蛋白及其受体或伴侣蛋白、GPR177、BMPs、TGFβTNF、TNF相关凋亡配体、FAS配体、细胞因子以及ECM蛋白（Fibronectin、Tenascin C、ECM1等）；
✅内外周膜蛋白
包括细胞骨架连接蛋白（ERMs）及其配体蛋白（EBP50、CD44、CD43、IGSF8、PTGFRN等）、Alix及其配体蛋白（TGS101、ESCRTs0-4）、分子伴侣HSPs蛋白（HSP70、Hsp40/DnaJ、Hsp90、Hsp20、Hsp27、α/β-crystallins）；
✅外泌体酶
包括CD39、CD73、磷酸酶、焦磷酸酶、钙结合连接蛋白、磷酸盐转运蛋白、RNA编辑酶、脂肪酶、蛋白酶、糖基转移酶、糖苷酶以及代谢酶等；
✅可溶性蛋白和内含物
CD81、CD9、CD63以及其他具有异质性的蛋白；
目前有多种外泌体提取方法，包括差速离心法、密度梯度离心法、试剂盒提取法、尺寸排阻色谱法、超滤法、聚合物沉淀法、免疫亲和分离法和压力筛分法等，其中差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。
✅形态表征
使用透射电子显微镜（TEM）（常用方法）、扫描电子显微镜（SEM）、冷冻电子显微镜（Cryo EM）或者原子力显微镜（AFM）等观察外泌体形态；
Tips：（1）一般至少使用两种方法进行形态鉴定；（2）外泌体呈现圆形且直径为40-150 nm。
✅粒径分布特征
使用动态光散射技术（DLS）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）（常用方法）以及可调电阻脉冲传感（TRPS）等分析外泌体直径大小；
✅蛋白标志物分析
根据国际细胞外囊泡研究协会（ISEV）建议，至少检测三类蛋白（两阳一阴）进行外泌体分析，具体包括：
（1）跨膜或GPI锚定蛋白（阳性）：CD63、CD9、CD81等；
（2）外泌体内部蛋白（阳性）：TSG101、HSP70以及Alix等；
（3）其他细胞器或细胞结构蛋白（阴性）：Histone、LaminA以及Calnexin等；
Tips：CD63、CD9、CD81、TSG101、HSP70以及Alix是最常用的外泌体标志物；
根据Cheng等人研究，外泌体保存液pH为pH 7.0，保存在-80℃条件下能最大程度保持外泌体活性和完整性，此外，尽量避免反复冻融也能维持外泌体活性和完整性。
