外泌体的传奇崛起之路

外泌体被当做“垃圾”忍辱负重几十年后，在近几年总算扬眉吐气，火的一塌糊涂，犹如一匹脱缰的黑马，在药物递送、液体活检、肿瘤治疗、医疗美容等领域异军突起，相关研究的文章数量呈井喷式增长，全球科研大咖纷纷扎堆于此，外泌体已然成为了生命科学和基础医学研究的一大热点。

01、什么是外泌体？

 

所有细胞（真核生物和原核生物），不论在生理条件还是在病理条件下均可以释放细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），细胞外囊泡根据来源和大小的不同，可以分为三类：

1、外泌体（Exosome）：由多囊泡体（multivesicular bodies, MVBs）与细胞膜融合，从而释放到胞外的大小在30~150 nm之间的一类囊泡。

2、微囊泡（Microvesicles）：由细胞膜直接向外出芽或裂殖形成的直径在100~1000 nm的一类囊泡。

3、凋亡小体（Appoptotic bodies）：凋亡小体是通过细胞发芽脱落机制或自噬体形成机制产生的直径在1000~5000 nm的一类囊泡。

 

外泌体具有和细胞类似的拓扑结构，携带有来源于母细胞的多种蛋白质、脂类、RNA和小分子代谢物等重要信息。

02、外泌体的“屈辱史”

 

回顾是为了更好的出发

让我们回顾一下外泌体的发现和发展之路，有助于更好的探索和研发！

2013年，外泌体因诺贝尔生理学与医学奖而被众人知晓，也因此将外泌体研究推向了前所未有的新高潮。外泌体在体液中广泛存在及易获得性等特点被誉为液体活检"新秀"，成为疾病的精确诊断和治疗研究的热点。

在细胞外囊泡发现75周年纪念之际，来自牛津大学等多位领域专家撰写关于细胞外囊泡简史，指出细胞外囊泡研究发展历程以及当前急需解决的问题。

细胞外囊泡研究历史

▉ 起源于凝血研究

细胞外囊泡的研究源于凝血研究。细胞外囊泡的第一次发现，是在1946年。彼时，美国生物化学家埃尔文·查戈夫（Erwin Chargaff）和医生兰道夫·韦斯特（Randolph West）在寻找凝血因子的研究中，发现经高速离心后的血液沉淀具有显著凝血功能。除了包含凝血因子，他们认为还存在血细胞小碎片，也就是细胞外囊泡。

▉ 外泌体功能的发现

在19世纪80年代早期，是细胞外囊泡研究的爆发时期。美国华盛顿大学医学院克里夫·哈定（Cliff Harding）通过研究网织红细胞成熟过程，发现外囊泡是由多囊泡体与细胞膜融合后释放。加拿大麦吉尔大学罗斯·约翰斯顿（Rose M. Johnstone）将通过这种生成途径产生的外囊泡定义为外泌体（exosome），并且认为外泌体只是一种“垃圾桶”，在网织红细胞成熟过程，将不需要的转铁蛋白受体运输到胞外。

直至2006~2007年发现外泌体携带mRNA和miRNA后，人们以一种新视角重新认识了外泌体，其作为一种新的遗传信息载体，在细胞间通信发挥重要作用，能够修改受体细胞内表达的基因范围。

03、外泌体的组成

外泌体具有脂质双层膜结构，携带母细胞的多种蛋白质、脂类和RNA等重要信息。外泌体的膜蛋白包括膜转运和融合相关蛋白、抗原呈递相关蛋白、黏附因子和其他跨膜蛋白，参与细胞的靶向运输、黏附作用和介导T细胞活化。外泌体内部蛋白包括信号转导蛋白、细胞骨架蛋白、ESCRT 组件、酶类和其他胞质蛋白。外泌体脂质包括鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、胆固醇和神经酰胺，主要参与分子信号转导。

外泌体携带有特定的mRNA、miRNA和其他的非编码 RNA，其作为主要的信息物质传递给靶细胞发挥调控作用。

04、外泌体的生物学发生过程

外泌体的生物学发生过程主要通过内体途径和多泡体途径，涉及细胞膜内陷、多泡体形成、与细胞膜融合释放等关键步骤23。

• 内吞作用：细胞质膜发生内吞或胞吞作用，形成早期内体（Early Endosome）25
• 膜内陷：细胞膜向内凹陷，形成含有液体的小囊泡3

• 早期内体的膜继续内陷出芽，形成多泡体（Multivesicular Bodies, MVBs）
• 多泡体内部包含多个小囊泡，这些小囊泡最终将发育成为外泌体2

多泡体具有两个主要去向5：

• 降解途径：与溶酶体结合，内载物被直接降解
• 分泌途径：与细胞膜融合，将内含的囊泡释放到细胞外

• 多泡体外膜与细胞膜融合后，向细胞外释放出外泌体
• 外泌体直径一般为40-100nm（范围30-200nm）2

外泌体由脂质双分子层包裹，包含：

• 蛋白质：热激蛋白（HSP70/HSP90）、四次跨膜蛋白（CD9、CD63等）2
• 核酸：mRNA、microRNA、ncRNA等2
• 脂质：各种生物活性脂质分子1

外泌体作为细胞间通讯的重要媒介，能够：

• 传递生物信息：通过受体-配体相互作用传递给受体细胞2
• 调控生物学行为：影响受体细胞的增殖、分化、凋亡等过程14
• 参与疾病进程：在癌症、神经退行性疾病等多种疾病中发挥重要作用4

这一复杂的生物发生过程使得外泌体成为疾病诊断和治疗的重要研究对象6。

外泌体释放到细胞外后，在组织液中移动到邻近的靶细胞，或在循环中移动到远处的靶细胞，并将信号传递给靶细胞，主要存在以下几种途径：

1、外泌体上的跨膜蛋白直接作用于受体细胞膜表面的信号分子，激活细胞内信号级联。

2、外泌体膜与细胞膜融合，将外泌体的内容物直接送入靶细胞内。

3、外泌体通过吞噬作用或内吞作用进入细胞。

05、外泌体的功能

根据细胞来源的不同，外泌体可以包含细胞的多种成分，包括RNA、脂质、代谢物以及细胞质和细胞表面蛋白质。不同来源的外泌体在不同的生理、病理阶段具有不同的功能。

 

清除作用：最初认为外泌体是细胞排除废弃物的一种方式，可以清除细胞中多余的或不必要的物质，维持细胞内环境的稳态。

细胞信使：外泌体作为细胞间信息交流的载体，可以将信号传递给靶细胞，调控靶细胞的生理活动。外泌体可以参与几乎所有的疾病过程，如感染性疾病、肿瘤、移植耐受、自身免疫性疾病、代谢性疾病等。但靶细胞摄取外泌体的不同方式是否导致外泌体成分的不同定位、降解和功能结果，目前尚不清楚。

 

06、外泌体的生物学特性

外泌体的天然结构：具有体积小、天然的分子转运特性、良好的生物相容性、循环时间长、能穿透深层组织等多种优点。

外泌体的异质性：不同细胞分泌的外泌体具有不同的功能和物质，相同细胞在不同的生理状态下分泌的外泌体也具有差异。

外泌体的靶向性：外泌体可以通过近分泌或旁分泌的方式作用于特定细胞。

通讯介质：外泌体携带有来源于母细胞的蛋白质、脂质、miRNA和RNA，可以反应母细胞的生理状态。

基于以上的生物学特性，外泌体在临床应用中可以作为一种天然的药物载体，在疾病诊断中可以作为一种理想的非侵入性生物标志物。

07、外泌体的分离

外泌体的分离主要有超高速差速离心法、密度梯度离心法、分子排阻色谱法、超滤法、聚合物沉淀法、免疫亲和捕获法、微流控技术、试剂盒法等8种方法，每种方法所依据的原理不同，都存在不同的优缺点。

超速离心法：是迄今为止应用最广泛的技术，也是外泌体分离的“金标准”。超速离心法是基于溶液中不同物质的沉降系数差别，通过超速离心将不同物质在不同转速下沉降下来，从而达到分离外泌体的目的，但超速离心耗时较长并且对设备的要求较高。

密度梯度离心法：是基于外泌体密度（1.13~1.21 g/mL）与其他杂蛋白密度不同的原理，设置不同浓度梯度的缓冲液，通过离心将外泌体与其他杂蛋白分开，从而实现外泌体的提取，该种方法的提取纯度较高但过程非常繁琐，耗时较长。

超滤法：是利用不同截留相对分子质量（MWCO）的超滤膜进行选择性分离，小分子物质会被过滤到膜的另一侧，而大于膜孔径的高相对分子质量物质则截留在超滤膜上。这种方法比较简单高效，也不影响外泌体的生物活性，但缺点是外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效率较低。此外，截留在膜上的外泌体间也会发生粘附，导致产量降低。

免疫亲和法：是基于抗原-抗体原理磁珠或滤膜将外泌体分离的方法，该方法可以获得单一的外泌体亚型，但其产量较低。

聚合物沉淀法：是聚合物通过“劫持”水分子，从而造成外泌体溶解度的降低，进而在低速离心条件下发生沉降，但是外泌体和杂蛋白会聚集在一起并离心沉淀下来，因此纯度不高。

分子排阻色谱法：是利用分子尺寸大小来分离外泌体的色谱分离技术，大分子物质不能进入凝胶孔，只能沿多孔凝胶间的缝隙流出色谱柱，所以它的流程较短，流速较快，而小分子物质能进入大部分凝胶孔，所以它的流程较长，而对应流速较慢，通过外泌体和其他蛋白质等颗粒大小的不同来分离出高纯度的外泌体。但是该方法耗时较长，不适合大量样本的处理。

微流控技术：是近年来多学科多领域交叉所产生的一种新兴技术，使用微管道（尺寸为数微米到数百微米）处理或操纵微小流体（体积为纳升到阿升）分离外泌体，具有分离速度快、纯度高、集成度高等优点，但制作工艺复杂、外泌体产量少的缺点限制了其应用的范围。

结语

外泌体具有稳定的物质基础与广泛的分布，功能多样，作用于生物生命活动的方方面面，目前对它的研究已是生命科学中的一个重要领域。

外泌体产业在欧美日益蓬勃发展，国内尚处在萌芽阶段，跨境投资合作更是凤毛麟角，是一个国内尚未被关注蓝海市场。从以往案例来看，比如CAR-T、 PD-1等，普遍来说海外和中国会有几年的时间差，并且这个延迟在一步步缩短。