外泌体抗衰 | 间充质细胞外泌体减弱 UVB 诱导的光老化

最近浙江省人民医院科学家团队在Biomaterials Research期刊上发表的一篇关于 “Human Hair Follicle Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Attenuate UVB-Induced Photoaging via the miR-125b-5p/TGF-β1/Smad Axis.” 文章（人毛囊间充质干细胞衍生的外泌体通过 miR-125b-5p_TGF-β1_Smad 轴减弱 UVB 诱导的光老化），展现了毛囊间充质细胞外泌体可以增加胶原形成，促进HDF细胞增殖和迁移，并逆转紫外线照射的HDFs的衰老。间充质细胞外泌体中的miR-125b调节Smad以逆转光老化，这为治疗皮肤光老化提供了一种有前途的治疗方法。

01 背景

皮肤光老化是皮肤光损伤的一种慢性表现，通常发生在暴露于紫外线(UV)辐射之后，其特征是细胞外基质的恶化和胶原蛋白水平的降低。

光老化进程和病理生理学中的一个关键事件是紫外线暴露后细胞外基质中胶原纤维的降解。这一过程的标志是紫外线照射后基质金属蛋白酶的产生上调，导致细胞外基质的主要成分1型胶原(COL-1)和3型胶原(COL-3)的分解。

光老化引起生理和心理并发症，导致审美退化和功能障碍。首先，药物治疗是光老化治疗的常用方法。药物治疗通常需要很长时间才能显示效果，并且可能对某些人群有副作用或禁忌症。其次，物理疗法在光老化治疗中也占有一席之地。这些治疗方法通常效果显著，但价格昂贵，需要专业医生进行，存在一定风险。此外，一些自然疗法和护肤品被用作光老化的辅助治疗。但是这些产品的效果因人而异，需要长期坚持使用才能看到显著效果。然而，目前预防和治疗光老化的策略是不充分的。因此，探索新的临床治疗方法势在必行。

间充质细胞衍生的外泌体(MSC-Exos)因其低免疫原性、改善的生物相容性和更广泛的扩散而被广泛用作组织损伤的治疗干预措施。MSC-Exos的愈合潜力归因于其旁分泌机制和愈合组织的能力。

外泌体作为细胞间遗传信息运输的天然机制，包括mRNAs、miRNAs、蛋白质和脂质，从而促进细胞间的交流。最近的研究表明miRNArich外来体与组织再生的病理生理学有关。虽然miR-125b对光老化疾病的影响仍在争论中，但一些研究人员已经观察到miR- 125b在UVA诱导的光损伤中表现出抗光老化特性。

02 研究数据

HFMSC-Exos降低衰老指标β-半乳糖苷酶水平

HFMSC-Exos对HDF增殖和迁移的影响。(A) 由HDFs内化的DiR标记的HFMSC-Exos的代表性图像。(B) 暴露于HFMSC-Exos后HDF增殖率的分析。(C) 暴露于HFMSC-Exos后HDFβ-半乳糖苷酶表达的代表性图像。(D)图(C)中每组中衰老细胞的比例。(E和F) 通过血管生成试验分析的暴露于HFMSC-Exos的人脐静脉内皮细胞的血管生成能力的代表性图像。(G和H) 使用划痕试验和transwell迁移试验
评价HFMSC-Exos对HDF迁移的影响。(I和J) 对图(G)和(H)的划痕迁移率和在transwell试验迁移的细胞数计算柱状图。HDF，人真皮成纤维细胞；HFMSC，人毛囊间充质细胞；HFMSC-Exos，人毛囊间充质细胞的外泌体；MSCs，间充质干细胞。

HFMSC-Exos上调COL-1/3的表达来减弱光老化

HFMSC-Exos表现出降低HDFs中活性氧物种表达的能力，这由DCFH-DA的荧光强度与UV照射组相比显著降低所证明(图A和B)。此外，HFMSC-Exos增强了HDFs中COL-1和COL-3的mRNA水平，并降低了MMP-1的mRNA水平(图C至E)。与UVB组相比，这些变化在统计学上是显著的(P < 0.05)，这在蛋白质水平上显示了类似的趋势(图 F至I)。NF-E2相关因子2增强细胞对氧化应激和损伤的保护。结果表明，与UVB组相比，暴露于HFMSC-Exos的HDFs中NF-E2相关因子2蛋白表达显著增加(图F和J)。这些发现表明，HFMSC-Exos促进细胞外基质的主要成分COL-1/COL-3的表达，导致细胞外基质重塑加速。此外，HFMSC-Exos下调MMP-1的表达并减弱胶原纤维的降解。

HFMSC-Exos通过抑制活性氧的产生和上调胶原蛋白的表达来加速细胞外基质的重塑。(A) DCFH-DA染色的代表性图像，以检测HFMSC-Exos从HDFs中清除细胞内活性氧的能力。(B) 图(A)中各组荧光强度的相对定量图。与UVB紫外线组相比，暴露于HFMSC-Exos的HDFs中活性氧的荧光强度显著降低。(C-E) 暴露于HFMSC-Exos的HDFs中COL-1、COL-3和MMP-1 mRNA表达的相对定量图。(F) 蛋白质印迹检测暴露于HFMSC-Exos的HDFs中COL-1、COL-3、MMP-1和Nrf2的蛋白表达条带。(G至J) 绘制了COL-1、COL-3、MMP-1和Nrf2蛋白表达的相对定量统计数据。COL-1，I型胶原蛋白；COL-3，III型胶原蛋白；基质金属蛋白酶1；CON，对照组；DCFH-DA，二氯二氢荧光素二乙酸酯；Nrf2，NF-E2相关因子2；MFI，平均荧光强度。

HFMSC-Exos减少光老化裸鼠的皱纹

使用动物模型进行皮肤光老化研究的主要挑战源于人类和动物之间皮肤结构和皮下组织的天然差异。在用于模拟光老化的各种物种中，无毛裸鼠是最常用的。用紫外光照射裸鼠的背部皮肤是一种被广泛接受的研究皮肤光老化的方法。这种偏好部分归因于裸鼠的无毛特性，与其他动物模型相比，这有助于观察紫外线照射或后续治疗导致的皮肤特异性变化。这项研究特别关注胶原蛋白的结构和排列。为了研究HFMSC-Exos在动物模型中的影响，将裸鼠的背部暴露于连续UVB照射8周以诱导光老化。

随后，通过皮下注射或涂抹施用HFMSC-Exos。对照片的分析显示，皮下注射HFMSC- Exos明显促进皮肤皱纹的恢复，而局部应用没有产生明显的效果，表明HFMSC-Exos的皮肤渗透性不足。这些发现是在HFMSC-Exo治疗2周后获得的，并且在HFMSC-Exo治疗后与预处理相比，观察到皮肤皱纹的统计学显著差异(P < 0.05)(图B和C)。此外，苏木精-伊红和Masson三色染色用于评估皮肤应用后胶原积聚的厚度和程度(图D至F)。还检测了从小鼠身上取下的皮肤中的血管生成标记CD31如图G和H所示，皮下注射外泌体促进了CD31的产生。结果显示，在HFMSC-Exo皮下注射治疗组中，真皮更厚，胶原纤维产量增加。体内研究进一步证实了HFMSC-Exos的抗光老化作用。

HFMSC-Exos对裸鼠光老化模型的影响。(B) 在第0周和第8周进行UVB紫外线照射并用HFMSC-Exos处理后，背部皮肤区域的照片。(C) 显示每组皱纹严重程度等级分数的条形图。(D) 在用HFMSC-Exos处理2周后，背部皮肤的H&E和Masson三色染色的代表性图像。(E-F) 切片中真皮厚度和胶原纤维的相对定量图。(G-H) 小鼠皮肤组织中CD31的代表性免疫组化图和CD31的相对含量。

HFMSC-Exos促进光老化裸鼠模型中的胶原产生

为了研究HFMSC-Exos对光老化裸鼠真皮中胶原合成的影响，在用HFMSC-Exos处理2周后获得皮肤组织以评估胶原和MMP-1的表达水平。分析收集的皮肤组织以确定COL-1、COL-3和MMP-1的表达水平。

结果证明了由HFMSC-Exo处理诱导的COL-1和COL-3表达的显著上调以及MMP-1表达的下调。图E和F中呈现的结果证明了前述发现在mRNA水平上的解释一致性。

测试了从小鼠获得的血清中的炎症因子，发现光老化小鼠中的浓度显著增加，这表明光老化导致了小鼠的炎症。当皮下注射HFMSC-Exos时，所有上述炎症因子恢复到正常水平。这表明HFMSC-Exos可以减少光老化小鼠的炎症 (图G至I)。

为了评估HFMSC-Exos在体内的安全性，对从小鼠获得的血清进行了生化测定。如图J至M所示，HFMSC-Exo处理的小鼠中的谷氨酸草酰乙酸转氨酶、谷氨酸丙氨酸转氨酶、尿素氮和肌酸酐清除率的水平与对照组中的相当，表明HF MSC-Exo具有良好的生物相容性。还对治疗期间小鼠的体重进行了统计分析，以测试HFMSC-Exos的安全性，显示小鼠体重没有显著差异，表明HFMSC-Exos具有良好的安全性。这些结果加强了HFMSC-Exos的抗光老化作用及其作为临床治疗方法的可行性。

03 研究方法

• 通过划痕和Transwell试验评估HFMSC-Exos对人真皮成纤维细胞增殖和迁移的影响。

• 通过血管生成试验评估HFMSC-Exos对人脐静脉内皮细胞的血管生成的影响。

• 用WB和qPCR检测HFMSC-Exos对胶原蛋白和基质金属蛋白酶1 (MMP-1)的表达水平的影响。

• 建立了光老化裸鼠模型，评估HFMSC-Exos对动物背部表面的皱纹形成、以及真皮厚度和胶原纤维生成的影响。

• 对HFMSC-Exos疗前后的小鼠皮肤组织进行了RNA测序和再验证，以阐明分子机制。

04 结论

HFMSC-Exos有效促进HDFs的迁移和增殖，并上调转化生长因子-β1 (TGF-β1)、p-Smad2/p-Smad3、1型胶原和3型胶原的表达，同时下调HDFs中MMP-1的水平。

此外，HFMSC-Exo组的小鼠显示出更快的皱纹愈合和增加的胶原蛋白生成。已证实HFMSC-Exos miR-125b通过TGF-β1表达增加促纤维化水平来减少皮肤光老化。

这项研究表明，在体外和体内，HFMSC-Exos增加胶原形成，促进HDF细胞增殖和迁移，并逆转紫外线照射的HDFs的衰老。

HFMSC-Exos的抗光老化能力可能是通过miR-125b/TGF-β1/Smad轴实现的，这为治疗皮肤光老化提供了一种有前途的治疗方法。