间充质基质细胞来源外泌体在增生性瘢痕防治中的研究进展

    增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)属于病理性瘢痕的一种，是创面过度愈合的结果。其病理学标志是过度的成纤维细胞增殖、肌成纤维细胞持续存在、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）异常沉积，以及胶原蛋白（collagen，Col）合成增加和排列紊乱［1］。HS存在疼痛、瘙痒、功能障碍，影响人类生活质量［2］。HS的治疗方案种类繁多，但疗效不尽理想［3-4］。间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）通过分泌的外泌体(exosomes derived from MSCs， MSCs-Exo) ［5-7］在创面愈合过程中发挥免疫调节、促血管生成、调控ECM重塑等作用，促进创面愈合的同时拮抗HS的形成［8-9］。MSCs-Exo是直径在30～150 nm的同质性囊泡，由MSCs来源的脂质双分子层包裹蛋白质、miRNA、mRNA、脂质体及细胞因子等形成，参与细胞间通讯［9］，实现旁分泌调控作用［10］。与其他MSCs相比，MSCs-Exo化学性质稳定、生物安全性高，可以浓缩、冷冻，而不会丧失活性［11］，易于储存、便于定量、移植后无免疫排斥［12］，被认为是具有较好转化应用前景的MSCs的“无细胞”治疗替代方案［13］。现将MSCs-Exo在HS防治中的作用机制、研究进展及存在的问题作如下综述。

    一、HS形成的病理基础及分子机制

   （一）过度炎症反应

    创面愈合需要合适的炎症微环境，创伤后中性粒细胞分泌IL-1α、IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）等启动炎症反应［14］，驱动巨噬细胞通过M1或M2表型的改变调控创面炎症程度，利于炎症期向增殖期过渡［15］。而过度、持续的炎症反应导致这一过程失调，出现IL-6的升高及Col异常沉积，形成HS［16］。另外，人类口腔黏膜及胎儿发育早期、非洲多刺小鼠的皮肤创面愈合后无瘢痕形成，可能与炎症时间短、转化生长因子β1 (transforming growth factor β1, TGF-β1) 和血小板衍生生长因子A（platelet derived growth factor A，PDGFA）水平低、巨噬细胞的水平和活化程度低有关［17-19］。且与正常皮肤相比，HS中的IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子均上调［20］。所以，过度的炎症反应促进HS的形成。

    人HS与正常皮肤组织的高通量测序结果显示TGF-β/Smad、PI3K-Akt等通路与ECM的沉积相关［21］：创伤诱导TGF-β激活Smad形成复合物转位至细胞核中调控靶基因的转录，促进肌成纤维细胞的分化及增殖，提高α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的表达水平、促进ECM沉积［22］。此外，TGF-β1还通过激活PI3K/AKT途径，通过抗凋亡蛋白Bcl2的激活抑制肌成纤维细胞细胞的凋亡，利于形成HS［23］。

    （二）成纤维细胞的功能异常及异质性

    作为真皮的主要细胞，成纤维细胞在创伤后增殖、迁移到创面，分泌Col、纤维连接蛋白等利于合成ECM、封闭创面，并转分化为肌成纤维细胞增加α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表达，利于创缘组织快速收缩、加快创面愈合。一旦创面再上皮化完成，成纤维细胞的增殖下降，肌成纤维细胞也凋亡消失了［24］。若是成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化过多、肌成纤维细胞代谢异常持续存在，将会导致ECM的合成和降解失衡，使HS形成［25］。

    另一方面，目前的研究发现瘢痕的形成及纤维化程度由独特的成纤维细胞亚群的行为决定：小鼠的遗传谱系追踪结果显示，在皮肤发育过程中，背部皮肤的成纤维细胞谱系从胚胎期的En1阴性表达（ENF）为主转变为成年期的En1阳性表达（EPF）为主，这可能是胎鼠与成年鼠HS形成与否的关键差异［26］。EPF在皮肤全层损伤模型中促HS形成的作用主要与其迅速增殖并聚集性迁移到创面中央及近表皮区、促进Col沉积有关［27］。

    （三）异常血管形成

    在创面愈合过程中，巨噬细胞分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生长因子、TGF-β等促进血管再生、再上皮化、ECM的合成等，加快创面愈合；但是VEGF水平过高也会导致血管内皮功能异常、微血管发育不佳，出现管腔狭窄或闭塞、微血管通透性差、组织缺血缺氧，导致HS形成［28-29］。Wnt/β-catenin信号通路中的β-catenin存在于成纤维细胞、内皮细胞等多种细胞类型中，Wnt信号通过抑制APC、Axin、GSK3β等复合体的功能，稳定胞质中游离的β-catenin并转移到细胞核内，通过靶基因的转录活动调节下游内皮细胞的功能，促进血管生成，利于创面愈合［30］。MSCs-Exo的表面膜上存在VEGF受体VEGFR1、VEGFR2，可以捕获过量的VEGF，控制血管化程度［31］，达到拮抗HS的作用。另外，在无瘢痕形成的非洲多刺小鼠与普通小鼠的皮肤损伤前后进行的皮肤蛋白质组学分析发现，Wnt信号通路存在差异，且与基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表达相关［19］。

    （四）创缘机械张力

    临床研究发现创缘张力的存在导致HS形成，通过调整手术切口走向降低创缘张力能减少或避免HS的发生［32］。研究证实，在小鼠的皮肤创面上皮化后施加张力，持续超过7 d可诱导HS模型形成，并可持续超过6个月，这个过程中表现为细胞凋亡减少，以及成纤维细胞的增殖及分化为肌成纤维细胞增多［33］，且TNF-α、IL-6、ColⅠ、TGF-β1的表达上调［32］，同时还促进了增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、α-SMA和Intergin-β1的表达［34］，这些因素共同促进Col生成及ECM沉积，导致HS形成［35-36］。压力疗法治疗巴马小型猪的HS时存在MAPK 信号通路的改变，说明其与HS密切相关［37］。研究发现，ERK/MAPK 通路抑制成纤维细胞的MMP3表达，阻断伤口修复中的 ECM 重建，利于HS形成［38］。

    （五）非编码RNA对HS的调控作用

    外泌体所携带的生物分子中，非编码RNA中的长链非编码RNA在基因表达调控中与mRNA协同发挥重要的作用，针对非编码RNA的研究，有助于进一步探索合适的HS防治方案，为其防治提供理论依据。对正常皮肤和HS的成纤维细胞进行基因微阵列分析发现存在6 104个lncRNA和2 952个mRNA差异表达［39］，相关研究包括：lncRNA中的AC067945-2可以促进成纤维细胞的早期凋亡，通过Wnt途径抑制Col1A1、Col1A2、Col3A1 和α-SMA 蛋白的表达，抑制VEGF分泌，改善HS的形成［40］；LINC00173参与PI3K/AKT和MAPK信号转导通路，抑制成纤维细胞的增殖、促进其凋亡而拮抗HS的形成［41］；人HS中的miR-627［42］、miR-205［43］、miR-124-3p［44］、miR-145-5p［45］等表达下调，他们分别通过靶向抑制胰岛素样生长因子-1、血小板反应蛋白-1、TGF-β1、Smad2/Smad3的水平，抑制人成纤维细胞的增殖并促进其凋亡，具有减轻HS的作用。

    二、不同外泌体对HS的防治作用

   （一）人脂肪来源的MSCs-Exo

    人脂肪来源MSCs-Exo（exosomes derived from adipose mesenchymal stromal cells，ADSCs-Exo）用于小鼠皮肤创面时，在早期上调IL-1β、IL6、巨噬细胞趋化蛋白-1等炎症相关因子的表达水平，调控炎症反应［46］。同时，ASCs-Exo被成纤维细胞吸收并募集到皮肤切口处，增加N-cadherin、cyclin-1和PCNA的基因表达，早期以剂量依赖的方式刺激成纤维细胞迁移、增殖、促进Col合成，促进创面愈合［47-48］。

    在HS形成过程中，ADSCs-Exo通过miR-34a抑制TGF-β受体［49］、下调TGF-β/Smad信号通路的p-Smad2、p-Smad3和TGF-β1等相关蛋白的表达水平，上调凋亡相关蛋白cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表达水平，下调凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平，促进肌成纤维细胞凋亡，降低Col、结缔组织生长因子、纤连蛋白和α-SMA的表达，拮抗HS的形成［47-48］。ADSCs-Exo应用于兔耳瘢痕模型中还降低VEGFA、PDGFB和TGFβ1的表达，调控血管生成的同时利于减少HS形成［50］。

    在伤口愈合后期，ADSCs-Exo抑制成纤维细胞的增殖，降低Col、结缔组织生长因子、纤连蛋白和α-SMA的表达，抑制ECM的合成，并通过ERK/MAPK通路增加成纤维细胞的MMP3的表达，利于Col的分解、ECM的重塑［38,50］。此外，ADSCs-Exo中存在波形蛋白的中间丝可以控制成纤维细胞对机械应力的反应，保护其免受渗透压力的影响，提高成纤维细胞对抗环境压力的能力［51］。另一方面，ADSCs-Exo中富含多种成脂miRNA，其中miR-450a-5p能通过靶向其3′非翻译区抑制WISP2的表达，调控ZNF423复合物与PPARγ-2转录激活因子的合成，激活Wnt信号通路，调节BMP4依赖的成脂分化过程，促进脂肪再生［52-53］，利于改善瘢痕质地、改善局部环境，利于毛囊等皮肤附属器的再生、恢复皮肤的结构及功能。

    （二）人脐带来源的MSCs-Exo

    人脐带来源的MSCs-Exo（exosomes derived from umbilical cord mesenchymal stromal cells，UC-MSCs-Exo）中存在miR-181c，在烧伤创面中通过抑制巨噬细胞的TLR4信号通路，降低IL-1β和TNFα的释放，提高IL-10的水平，起着关键的炎症调节作用［54］。另外，UC-MSCs-Exo通过Wnt4进入内皮细胞，激活Wnt/β-catenin信号通路、增加N-cadherin、cyclin-D3、PCNA的基因表达，减少E-cadherin的表达，促进内皮细胞增殖、迁移，利于血管生成、促进创面愈合［30］。此外，UC-MSCs-Exo传递Wnt4、粒细胞集落刺激因子、PDGF-BB、VEGF、单核细胞趋化蛋白-1、IL-6、IL-8等多种细胞因子，影响Wnt下游的PI3K/AKT通路的激活，部分抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活［55］、以及通过UC-MSC-Exo携带的miR-21、miR-23a、miR-125b和miR-145抑制TGF-β/Smad2通路，抑制伤口愈合过程中的成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，降低α-SMA、ColⅠ的表达及减少ECM的沉积，抑制HS形成［22］。

    （三）人脐血来源的MSCs-Exo

    人脐血来源的MSCs-Exo刺激内皮细胞可以增加成纤维细胞生长因子-1、 IL-8、 VEGFA、 VEGFR-2、E-selectin等血管生成相关分子的表达，增强血管内皮细胞的增殖、迁移，促进血管形成，利于伤口快速愈合［5-6］。同时，人脐血来源的MSCs-Exo中包含的miR-21-5p 和miR-125b-5p分别抑制TGF-受体 Ⅱ 型和Ⅰ型，通过抑制TGF-β1的功能，拮抗成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，减少Col I的形成［57］。此外，其中存在的miR-21-3p还通过抑制PTEN抑制PIP2向PIP3的磷酸化过程，抑制PI3K/AKT通路的进行，抑制成纤维细胞的增殖、向肌成纤维细胞的转化、促进凋亡等，减少皮肤瘢痕宽度［58］。 

    （四）人骨髓来源的MSCs-Exo

    源自骨髓的MSCs-Exo（exosomes derived from bone marrow mesenchymal stromal cells，BMSCs-Exo）中存在miR-21-5p，通过PI3K/AKT 和 ERK 1/2信号通路改善血管生成和成纤维细胞的功能、促进创面愈合［59］，另一方面，BMSCs-Exo中也存在miR-126，可以通过介导PTEN抑制PI3K/AKT通路的进行，抑制成纤维细胞的增殖、抑制其向肌成纤维细胞的转化，并促进肌成纤维细胞凋亡等抑制HS的形成［60］。

    （五）人羊膜上皮来源的MSCs-Exo

人羊膜上皮来源的MSCs-Exo干预体外培养的人成纤维细胞时存在差异表达的mRNA 262个、lncRNA 172个和circRNA 45个，基因的富集分析结果显示，这些差异基因多参与细胞黏附、TGF-β、缺氧诱导因子-1、PI3K-Akt、ECM-受体信号等通路的调节，导致纤维化相关基因的下调［21］。其作用于大鼠皮肤伤口模型时可通过刺激MMP-1的表达，部分消除ECM的沉积，促进胶原纤维的成熟，减少了HS形成的可能［9］。

    （六）人羊水来源的MSCs-Exo

    人羊水来源的MSCs-Exo（exosomes derived from amniotic fluid mesenchymal stromal cells，AFSCs-Exo）包含TGF-β、肝生长因子，参与免疫调节，降低共培养的淋巴细胞的增殖率，且对不同淋巴细胞的分化、活化和功能进行调节，利于控制炎症反应［61］。同时，AFSCs-Exo的表面膜上存在VEGF受体VEGFR1、VEGFR2，并通过这些受体捕获过量的VEGF，控制血管化程度［31］。AFSCs-Exo在治疗皮肤创面时通过抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，显著降低了α-SMA阳性肌成纤维细胞的表达，创面愈合后ColⅠ显著减少、Col Ⅲ增加，改善了ECM重塑的质量，实现其抗纤维化作用［62］，这些途径共同作用，减少了HS的形成。

    四、外泌体治疗HS应用中的挑战

    外泌体存在于各种体液的细胞中，目前存在多种提取纯化方式，但不同的提取方式存在质和量的差异，且可能掺杂大小类似的囊泡、小分子杂蛋白，影响实验效果［63］。同时，目前的研究尚不能清楚描述其中存在的DNA、RNA、非囊泡性物质等功能性亚单位的具体情况，以及表面脂质成分对其功能及活性的影响、不同批次间可能存在差异，导致外泌体的推广应用受阻［64］。另一方面，外泌体的质量取决于细胞类型、环境条件和其他因素（比如感染或人工诱导等）［65］，尚不清楚不同的培养环境对MSCs-Exo的组分及功能有着怎样的影响，以及标准状态下获取的MSCs-Exo进入不同的疾病微环境后会有怎样的变化，针对这些问题，我们建议需要根据疾病微环境特异性地诱导MSCs，利于产生精准治疗相应疾病的外泌体组分［66-67］。

    五、小结与展望

    MSCs-Exo来源广泛，避免了MSCs移植中存在的安全性及归巢等相关问题，其携带的生物活性因子性质稳定，可以靶向特定细胞、介导细胞间通讯，也可用作药物或基因编辑系统的递送载体。目前的研究发现MSCs-Exo作用于皮肤创面时不仅能促进伤口愈合，还起着显著的抗纤维化作用，在HS的防治领域起着重要作用。尽管关于MSCs-Exo在HS防治领域的研究已经取得了一些成果，但是仍处于初级研究阶段。在未来的研究中，我们应当深入解读外泌体的内部活性亚单位及其生理功能、不同微环境对其结构及成分功能等的影响，以及分子运载机制，为以后进行针对性的人工合成功能性的外泌体、根据不同疾病制定个性化的外泌体的治疗方案做好准备。