外泌体（exosomes，Exos）是脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，AD- SCs）主动分泌的纳米大小的膜性囊泡，通过自身含有的生物活性分子如长链非编码 RNA（ln- cRNA）、微小 RNA（miRNA）和环状 RNA（circRNA）等非编码 RNA（ncRNA）进入相应的靶细胞，参与细胞间通讯。脂肪间充质干细胞外泌体源非编码 RNA（ADSC-Exo-ncRNA）可调控机体免疫和炎症反应、血管生成，加速皮肤细胞增殖和上皮化，调节胶原重塑，从而增强创面修复能力。因此，ADSC-Exo- ncRNA 在创面修复过程中发挥重要作用，有望成为创面修复治疗的新策略。本文对近年来 ADSC- Exo-ncRNA 在创面愈合中的作用及其应用前景进行综述。
脂肪间充质干细胞 ；外 泌体 ；非编码RNA；创面愈合
创面愈合是一个复杂但有序的过程，包括止血、炎症、增殖和皮肤重塑 4 个阶段。基于间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的治疗因其招募细胞和释放生长因子和蛋白质的能力显示出巨大的创面愈合潜力，尤其是脂肪来源的 MSCs（adipose - derived mesenchymal stem cells， ADSCs）。ADSCs 具有更高的增殖能力和更晚的衰老以及更强的细胞分裂能力，是治疗慢性创面 的理想干细胞，在免疫调节、血管新生重建、皮肤创面愈合和组织再生中起作用，但仍存在缺乏标准化的剂量或分离方案、免疫排斥、代谢障碍以及干细胞的染色体变异等问题。
ADSCs 分泌的外泌 体（exosomes，Exos）避免了免疫排斥和肿瘤发生的风险，参与包括炎症、 血管生成、细胞增殖等生物学过程，调控创面修复过程。Exos 作为载体携带生物活性分子，包括蛋白质、复合物和非编码 RNA（ncRNA）等，参与细胞间通讯和物质交换。ncRNA 主要分为长链非编码 RNA（lncRNA）、microRNA（miRNA）和环状 RNA（circRNA），被认为是 Exos 的有效成分。这些序列不编码蛋白质，而是在基因表达的转录协调和转录后调控中起调节作用。Exos 递送的 ncRNA 已被证明在靶细胞中介导重要的表型效应，因此它们可以作为创面愈合中新的治疗靶点。本文重点综述 ADSC-Exo-lncRNA /miRNA/ circRNA 在 创面愈合过程中的作用研究进展，以期探讨作为创面治疗新策略的可能性。
外泌体的特征和功能
Exos 是直径约为 30～150 nm 的细胞外囊泡， 存在于体液中，包括尿液、血浆、脑脊液、乳汁和唾液，并可由多种哺乳动物细胞类型分泌，包括 MSCs、癌细胞、免疫细胞和神经元。Exos 生物发生涉及三个主要步骤：内吞囊泡通过质膜内陷产生，通过内体膜向内出芽形成多泡体（MVBs）， 当 MVBs 与质膜融合时，Exos 从细胞中释放或直接从质膜释放分泌，参与细胞间通讯。Exos 富含多种生物活性分子，包括蛋白质、信使 RNA（mRNA）、转运 RNA（tRNA）和 ncRNA 如 lncRNA、miRNA、circRNA。由于独特的脂质双层结构，Exos 保护内容物不被降解，将 DNA、ncRNA 等生物活性物质从亲代细胞传递到受体细胞，进一步介导细胞间通讯。已有研究证明，MSCs 来源的 Exos 继承了干细胞的治疗潜力，可通过有效调控免疫炎症反应、细胞增殖、迁移和血管生成，促进创面愈合。
脂肪间充质干细胞外泌体
来源于 MSCs 的 Exos 由于含有不同的遗传物质与蛋白质参与创面修复，特别是 ADSC-Exos 递 送的 ncRNA 可能通过多种机制参与创面愈合过程。脂肪组织基质血管部分中含有丰富的 AD- SCs，具有无需侵入性程序即可轻松提取、增加丰度及快速扩增、自我更新和多向分化能力、免疫原性低以及优异的旁分泌潜能的优势。Exos 继承了 ADSCs 的部分功能和生物学特征，可通过调控创面中的炎症反应、血管生成、细胞增殖和再上皮化等多种途径促进创面愈合，同时避免了 ADSCs 直接移植面临的感染、致瘤、栓塞等风险。与其他 MSCs 类型相比 ，ADSCs 可以分泌更多的 Exos。ADSC-Exos 有望成为创面愈合的新策略，但具体机制有待进一步研究。
脂肪间充质干细胞外泌体 lncRNA 在创面愈合中作用
LncRNA 长度超过 200 个核苷酸，不能编码蛋白质，但可以通过表观遗传、转录和转录后修饰来调节基因表达。目前研究更多关注 lncRNA 作为调节 miRNA 的竞争性内源性 RNA（competi- tive endogenous RNA，ceRNA），减少参与创面愈合的 mRNA 降解。研究表明 ADSC-Exos 包含多种 lncRNA，包括 H19、Linc00511 和 lncRNA MALAT1 等，可以转移到皮肤成分细胞中，介导靶基因和蛋白表达水平的改变，参与炎症和免疫反应、血管新生、再上皮化和细胞外基质重塑促进创面愈合。
3.1 调节炎症和免疫反应
炎症期决定了创面的愈合过程，创面中巨噬细胞极化抗炎细胞 M2 表型失调及过量促炎性细胞因子的表达导致慢性创面。因此，良好的炎症调节保证了创面愈合。研究证明 lncRNA 如 CASC2、GAS5、Ftx 和 SOX2OT 可靶向 miRNA 参与创面愈合的炎症反应。LncRNA CASC2 下调 miR-144 表达，靶向上调细胞因子信号传导抑制因子 2（Suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2）表达进一步抑制 IL- 1β 和 TNF- α 等炎症因子的释放从而缓解炎症。同样发现 LncRNA GAS5 竞争结合 miR-520-3p 靶向 上调 SOCS3 表达，减少炎症因子释放进而抑制脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的巨噬细胞炎症反应。LncRNA Ftx 抑制 miR-382-5p 表达水平促进神经调节素-1（Neuregulin-1 ，Nrg1）表达，减少炎症因子并改善炎症。lncRNA SOX2OT 通过抑制 miR-215-5p 表达，上调细胞间粘附分子 1（Inter- cellular adhesion molecule 1，ICAM1）促进 LPS 诱导的炎症损伤。此外，MSC-Exos 通过 lncRNA H19 降低促炎因子 IL-1β 和 TNF-α 水平，升高抗炎因子 IL- 10 水平，改善创面炎症。进一步研究发现，AD- SC-Exos 的 lncRNA H19 通过促进巨噬细胞 M2 极化，靶向 miR-130b-3p/PPARγ/STAT3 轴从而减弱炎症加速创面愈合。然而，关于 ADSC-Exos 的 ln- cRNA 在调节创面炎症的相关研究仍较少，需要深 入探索。
3.2 血管新生
创面愈合在很大程度上依赖于血管形成、血管生成和提供必要的氧气供应来刺 激修复和新生血管。血管生成涉及局部微血管内皮细胞（ECs）的激活。在缺氧的创面环境下，ECs 通过促血管生成信号如血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和血管生 成素来生成血管。近来研究表明 ADSC-Exo-ln- cRNA 参与血管生成。Sun 等人验证了 ADSC-Exos 中的早期生长反应因子-1（Early growth response factor-1，EGR-1）显著促进人脐静脉内皮细胞（Hu- man umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的增殖 、迁移和血管生成，加速创面愈合，这与 ln- cRNA-SENCR/DKC1/VEGF-A 轴有关。此外，在 Qiu 等人的研究中，过表达 Linc00511 的 ADSC- Exos 通过抑制内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）中黄体酮和脂肪 q 受体家族成员 3（PAQR3）抑制 Twist1 的泛素化和降解，从而上调 Twist1 的表达，恢复 EPCs 的生物学能力，加速血管形成，从而促进创面愈合。
3.3 再上皮化
在增殖期，成纤维细胞增殖产生细胞外基质（ECM），同时上皮细胞向创面中心迁移以促进创面愈合。研究表明 ADSC- Exo - ln- cRNA 可以调控创面中的成纤维细胞促进创面愈合。过量表达 H19 的 ADSC-Exos 抑制 miR-19b 水平，上调 SOX9，从而激活 Wnt/β-catenin 信号通路，促进成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭,加速再上皮化。Zhu 等人发现 ADSC-Exos 负载的 XIST 通过 XIST/miR-96-5p/DDR2 促进小鼠真皮成纤维细胞的增殖和迁移，促进创面愈合。研究还发现 ADSC-Exos 释放的 MALAT1 增加成纤维细胞迁移，加速创面愈合。进一步研究发现含有 MALAT1 的 ADSC-Exos 可以通过靶向 miR-124 并激活 Wnt/ β-catenin 通路促进成纤维细胞增殖、迁移，抑制细胞凋亡。另一项研究也表明 ADSC-Exos 转运 的 MALAT1 通过靶向 miR-378a 增加 FGF2 水平促进成纤维细胞增殖和迁移，加速再上皮化。
3.4 细胞外基质重塑
创面重塑是愈合过程的最后阶段，在此期间，瘢痕的程度由合成和降解的 ECM 的数量决定。增生性瘢痕（HS）是创面愈合的病理反应，其特征是成纤维细胞的异常增 殖和胶原蛋白的过度沉积。ADSC-Exos 通过激活 ERK/MAPK 通路，增加Ⅰ型胶原/Ⅲ型胶原、TGF-β 3/TGF-β1、MMP3/TIMP1 的比例，从而阻止成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，抑制瘢痕形成。研究表明 LncRNA8975-1 在增生性瘢痕成纤维细胞中上调并控制胶原蛋白表 达。此外 ，lncRNA H19 敲低抑制了瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、迁移 、侵袭和 ECM 沉积。进一步研究发现 ln- cRNAH19 通过 miR-196b-5p 上调 SMAD 家族成员 5 表达来加重瘢痕疙瘩进展。
脂肪间充质干细胞外泌体 microRNA 在创面愈合中作用
MiRNA 是一类长度为 17-24 个核苷酸的非编码 RNA，通过与靶基因的 3 ′ -非翻译区（3 ′ -UTR）相互作用导致 mRNA 降解或翻译抑制。MiRNA 通过控制皮肤细胞的增殖、分化和凋亡，在创面愈合中起着关键的调节作用。MiRNA 可以封装在 Exos 中，由 Exos 携带并释放到靶细胞或组织中。基于 Exos 的 miRNA 传递可能比基于血浆的 miRNA 传递更有效，避免生物活性降低以及低酸 性 pH 值和 Rnase 介导的降解。ADSC-Exos 含有丰富的 miRNA，包括 miRNA-10a、miRNA-21、miR- NA-31、miR - 126-5p、miRNA - 451a、miRNA - 125a、 miR-106a-5p、miR-144-3p、miR-210、miR-486-5p、 miR-423-5p 和 miR-126-3p 等。在创面愈合过程中，它们参与调节炎症反应、血管生成和稳态、ECM 生成和再上皮化，已被证明在调节创面愈合 的进展中起着关键作用。
4.1 免疫调节和炎症反应
ADSC-Exos 可以作为 有效的免疫调节剂和理想的递送 miRNA 的载体，调节免疫反应和炎症反应。负载 miR-10a 的 AD- SC-Exos 促进 Th17 和 Treg 从初始 CD4+ T 细胞分化，IL-17、TGF-β 的分泌水平升高，IFN-γ 的分泌水平降低，加强了免疫反应，促进创面愈合。基 于高通量测序 ，Wang 等人发现，与未经处理的 ADSC-Exos 相比，经缺氧预处理的 ADSC-Exos 中的 215 个 miRNA 上调，369 个 miRNA 下调。与常氧相比，缺氧诱导后的 ADSCs 显示出增强的旁分泌效应，分泌的 Exos 的治疗效果显著增强。缺氧预处理的 ADSC-Exos 中 miR-21-3p/miR-126-5p/miR-31- 5p 的上调和 miR-99b/miR-146-a 的下调通过磷脂 酰肌醇 3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（AKT）信号通路抑制炎症因子的释放，促进糖尿病创面愈合。
4.2 血管新生
ADSC-Exo-miRNA 可直接影响或间接在基因表达，蛋白水平上促进血管生成加速创面愈合。ADSC-Exos 的 miRNA-31、miR - 423 - 5p 和 miRNA-125a 已经被证实可以促进血管内皮细胞的增殖和迁移、诱导血管生成加速创面愈合。除了直接促进血管生成外，有大量研究 表明 ADSC-Exos 通过 miRNA 促进高水平的血管生成细胞因子和生长因子分泌来促进血管生成。来自 ADSC-Exos，特别是来自缺氧 ADSC-Exos，通过 miR- 21 靶向下调磷酸酶及张力蛋白同源基因（PTEN）激活 PI3K/AKT 通路促进 M2 极化，增强缺氧诱导因子- 1α（Hypoxia-induced factor - 1α，HIF - 1α）和 VEGF 的表达来促血管生成。经 mmu_circ_0001052 修饰的 ADSC - Exos 通过 miR - 106a - 5p 和 FGF4 / p38MAPK 途径，增强 FGF4 和VEGF 的表达促进血管生成。来自缺氧预处理ADSC- Exos 的 circ-Snhg11 通过激活 miR- 144 - 3p/ HIF-1α/VEGF 信号通路促进血管生成，从而促进 创面愈合。此外，ADSC-Exos 释放的 miR-132 和 miR-146a 上调促血管生成基因如血管生成素 1（ANGPT1）和 flk1（KDR）的表达，降低抗血管生成 基因如血管生成抑制蛋白 1（VASH1）和血小板反应蛋白- 1（THBS1）的表达，从而增加血管生成。高表达 mmu_circ_0000250 的 ADSC-Exos 靶向 miR- 128-3p 上调沉默信息调节因子 1（SIRT1）表达促进创面血管生成。
4.3 促进细胞增殖
ADSC-Exo-miRNA 可以通过信号通路调节成纤维细胞和角质形成细胞的增 殖和迁移。MiRNA 微阵列分析显示，促进真皮成纤维细胞增殖和分化的 ADSC-Exos 中 有 292 个 miRNA 发生改变，其中 199 个表达上调，93 个下调。Choi 等人发现 ADSC-Exos 通过抑制 NPM1、PDCD4、CCL5 和 NUP62 等基因的 miRNA，与皮肤再生相关的基因如Ⅰ型胶原蛋白和角质形成细胞生长因子（KGF）的表达增加，促进真皮成纤维细胞 的增殖和分化，从而有助于皮肤成纤维细胞的再生。研究表明 miRNA-146a 修饰的 ADSC- Exos 通过上调丝氨酸家族 H 成员 1（SERPINH1）和磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERK），促进成纤维细胞增殖和迁移。此外，ADSC-Exos 的 miR126-3p 过表达抑制 PIK3R2，促进成纤维细胞的增殖迁移和减少细胞凋亡从而提高大鼠皮肤缺损的创面愈合率。研究表明 miR-378 在 ADSC- Exos 中含量丰富，可靶向半胱天冬酶-3（caspase-3）降低角 质形成细胞细胞的氧化应激损伤。过表达 miRNA21 的 ADSC-Exos 通过 PI3K / AKT 通路增加 MMP-9 的表达，从而增强 HaCaT 细胞的迁移和增殖。
4.4 抑制瘢痕增生
ADSC-Exo-miRNA 可调节胶原重塑，抑制瘢痕增生。早期，Exos 通过合成Ⅰ型 胶原和Ⅲ型胶原促进胶原重塑，而晚期通过抑制 胶原形成来减少瘢痕形成。研究显示 ADSC- Exos 中高表达的 miRNA-21 可以通过 PI3K/AKT 途 径增加 MMP-9 和 MMP-3 蛋白的表达，抑制 TIMP- 1 和 TIMP-2 蛋白的表达。在组织重塑阶段，肌成纤维细胞的出现也是必不可少的。然而，在成 人创伤愈合过程中，肌成纤维细胞的过度分化会导致创面形成纤维化瘢痕。ADSC-Exo-miRNA可调节成纤维细胞中基因表达，阻止成纤维细胞向肌成纤维细胞分化减少瘢痕的形成。Li 等人发现 ADSC-Exos 中的 miR-192-5p 靶向下调成纤维细胞中 IL-17RA 的表达，调节 Smad 通路减少胶原沉积，抑制肌成纤维细胞活性，减轻增生性瘢痕纤维化。同时，研究发现经 miR-29a 修饰的 ADSC- Exos 通过抑制 TGF-β2/Smad3 信号通路，阻止成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，减少过度的瘢痕形成。
脂肪间充质干细胞外泌体 circRNA 在创面愈合中作用
CircRNA 是一种单链的内源性非编码 RNA，通过共价闭合构成了独特的环状结构，具有性质稳定、表达量丰足、高度保守、细胞特异性、组织特异性等特点。CircRNA 可以充当 miRNA 海绵或 ceRNA，与其他 RNA 竞争 miRNA 配对，还可以调节细胞核中的转录以及与蛋白质因子结合。一 项研究通过高通量基因测序比较了慢性难治性创面和正常皮肤组织中 circRNA 和 miRNA 的差异表达，发现糖尿病患者创面组织与正常组织基因 表达差异较大，在 356 个差异表达的 circRNA 中 157 个上调和 199 个下调，在 42 个差异表达的 miRNA 中 2 个上调和 40 个下调，为进一步探究其在创面愈合过程中的作用提供了重要证据。
ADSC-Exos 通过递送 circRNA 在创面愈合过程发挥重要作用。来自缺氧预处理 ADSC-Exos 的 circ-Snhg11 可通过调控 miR-144–3p/HIF-1α/STAT3 信号通路促进 M2 型巨噬细胞极化。结果还证实，circ-Snhg11 通过激活 miR-144-3p/HIF-1α/VEGF 信号通路增加 EPCs 的血管分化功能，促进糖尿病创面愈合。另一项研究发现，富含 circ-Astn1 的 ADSC-Exos 抑制 EPCs 中 miR-138-5p 的表达并促进 SIRT1 表达和抑制叉头转录因子 O1（forkhead box O1，FoxO1）表达，抑制细胞凋亡恢复 EPCs 功能，从而促进血管生成加速创面愈合。文献报道 ADSC-Exos 中的 circRNAs 在 EPCs 的增殖、迁移中发挥作用，此外还可通过调控血管内皮细胞促进血管生成因子如 VEGF、FGF、血小板衍生生长因子（PDGF）等表达促进创面愈合。在缺氧预处理 的 ADSC-Exos 中高表达的 circ-Gcap14 通过抑制下游 miR-18a-5p 和促进 HIF-1α 在小鼠创面模型中的表达，增加血管生成生长因子的表达并加速创面愈合。ADSC-Exos 中的 mmu_circ_0001052 通过减少 miR-106a-5p，升高 FGF4 和 VEGF，激活 p38 MAPK 途径促进创面血管生成。然而，ADSC- Exos 中的 circRNA 在创面愈合中的确切作用及其机制在很大程度上仍未完全阐明。
总结与展望
创面尤其是慢性创面目前仍然是临床面临 的巨大挑战。创面愈合受炎症、细胞增殖、血管 生成和 ECM 重塑的影响。ncRNA 可以调节这些过程以促进创面愈合。由于高生物相容性和低毒性，ADSC-Exos 作为理想载体递送 ncRNA，表现出显著的稳定性和更持久的活性，更容易转移到 靶细胞中发挥功能促进创面愈合。
目前关于外泌体 ncRNA 的研究仍然面临一 些挑战 ：（1）Exos 的分离效率和质量仍不理想。由于年龄、样品采集、制备或储存等因素导致细胞裂解或 RNA 降解所获得的蛋白质和 RNA 含量存在显著差异，因此必须对 Exos 分离方法进行标准化。（2）Exos 在细胞间特异选择性传递生物活性分子介导细胞间通讯。然而，分子是如何合成并选择性地包装到 Exos 中，需要进一步的研究来揭示其具体机制。（3）ADSC - Exos 中特异性 ncRNA 所处的局部微环境会影响其生物学效应的发挥，功效可能受到来自亲代细胞的非特异性 ncRNA、杂质和细胞碎片影响。（4）Exos 可以被设计成递送系统传递 ncRNA 到靶细胞用于治疗。但外泌体 ncRNA 在临床转化前仍有许多实际问题需要解决，包括给药途径、生物分布、安全性、 生物学功能、有效剂量和治疗窗口期等。
在基因治疗中，针对 Exos 被设计成递送系统传递特异性 ncRNA，由于游离 Exos 被快速清除，Exos 与生物材料的结合将成为基因治疗的主要焦点。最近研究表明，包裹在 PF-127 水凝胶中的 ADSC-Exos 被缓慢释放促进创面愈合，该组合具有控制递送，持续释放 Exos 和减少给药频率的优点。Jiang 等人将 ADSC-Exos 加载到基质金属蛋白酶可降解 PEG（MMP-PEG）智能水凝胶中，该水凝胶可以通过响应 MMP 刺激反应释放 Exos，通过 Akt 信号增强细胞功能，同 时缓解H2O2 诱导的氧化应激，加速创面愈合。此外，近年来，一种基于红细胞膜的纳米药物靶向递送系统因其具有出色的靶向性和免疫逃逸能力，为静脉注射的不足提供了解决方案。目前关于 AD- SC-Exo-ncRNA 在创面愈合应用的研究可能只是冰山一角，但该治疗策略在创面愈合中前景广阔。
