外泌体工程化技术全景图，让药物递送突破传统限制？
外泌体工程化：开启药物递送的新时代
01
外泌体递送载体的优势
外泌体是细胞自然分泌的囊泡，广泛存在于各种生物体中，包括哺乳动物细胞、真菌、细菌和植物。它们的尺寸通常在30至150纳米之间，具有磷脂双层膜结构，能够保护内部的生物分子免受外界环境的破坏。这种天然的保护机制，使得外泌体成为理想的药物递送载体。它们可以轻松穿越血脑屏障等复杂生物屏障，精准地将药物递送到目标细胞或组织，同时减少药物在非靶组织的分布，降低副作用。
EVs在药物递送中的优势包括生物相容性好、靶向编辑性强、药物保护作用等。
生物相容性：EVs来源于生物体，具有良好的生物相容性。
靶向性：EVs可以通过表面修饰实现对特定细胞或组织的靶向递送。
药物保护：EVs的膜结构可以保护药物免受降解，提高药物的稳定性和疗效。
02
外泌体载体工程化策略
尽管外泌体在药物递送中具有诸多优势，但天然分泌的外泌体存在一些局限性，例如药物装载量有限、靶向性不足等。
为了克服这些限制，科学家们开始探索外泌体的工程化技术，通过人为干预来增强其药物递送性能。外泌体工程化主要包括以下几种策略。
内源性装载（Endogenous Loading）：在EVs生物合成过程中，通过修改EVs产生细胞来装载药物或生物分子。
外源性装载（Exogenous Loading）：在EVs分离后，通过物理或化学方法将药物或生物分子装载到EVs中。
体内工程（In Vivo Engineering）：通过在体内对细胞进行基因或化学修饰，使其分泌的EVs具有特定的功能。
工程化EVs的目标示意图
工程化EVs的目标示意图。工程化EVs的主要目标包括提高EVs的靶向性，以实现其对特定细胞的摄取，并尽量减少非靶细胞的积累。在EV表面结合聚乙二醇聚合物（PEGylation）可以通过减少循环巨噬细胞的吞噬作用来延长EV的循环时间。EVs可以被工程化以装载外源性小分子药物、质粒DNA、治疗性蛋白质和不同类型的RNA。最后，EVs可以被工程化以标记其腔内或膜成分，以追踪它们在体外和/或体内的细胞摄取、药代动力学和生物分布。
这张图清晰地描绘了外泌体工程化的四大目标：细胞特异性靶向、增加循环时间、装载外源性药物以及EVs的标记与追踪。这些目标的实现，将使外泌体在药物递送中发挥更大的作用。
内源性装载
从源头提升药物装载量
在EV分离前将小分子和大分子内源性装载到EVs的示意图。在EV分离之前将小分子或大分子装载到EVs中有两种主要方法。 a)将EV产生细胞与自由小分子药物、标记染料或可能被运输到细胞质中的生物大分子共同孵育。随后，这些分子被包裹到通过内质网膜向内出芽形成的外泌体中，随后形成多泡体，或者通过质膜向外出芽形成微囊泡。 b)使用病毒或非病毒载体转染核酸。可以将含有核酸的病毒载体（如腺相关病毒或慢病毒）或非病毒载体（如脂质体复合物或聚合物复合物）与EV产生细胞共同孵育，以将核酸转染到细胞中。转染的核酸要么直接整合到外泌体或微囊泡中，要么被转录为RNA并进一步翻译成蛋白质，这些蛋白质在它们的生物合成过程中被包裹在外泌体和微囊泡中。
EVs表面修饰的内源性装载
在EV分离前将生物大分子内源性装载到EVs的示意图。可以通过两种方法对EV产生细胞进行工程改造。 a) EV产生细胞的基因工程：将编码目标基因的质粒DNA与编码EV膜蛋白的基因融合，通过病毒或非病毒载体转染到EV产生细胞中。质粒DNA进入宿主细胞核，转录成RNA，并翻译成融合蛋白。融合蛋白包含EV跨膜蛋白和目标蛋白的融合。EV跨膜蛋白在EV生物合成过程中被整合，从而将目标蛋白装载到EV膜的内部或外部。 b) EV产生细胞的代谢工程：用小分子（如甘露糖胺衍生物）处理EV产生细胞，这些小分子能够进入细胞并产生糖链，这些糖链被整合到EV跨膜蛋白中。在EV生物合成过程中，含有糖链的蛋白被整合到EVs中，从而分泌出表面带有糖链基团的工程化EVs。这些含糖链的EVs可以用于通过点击化学共轭标记染料或靶向肽。
外源性装载
为外泌体添砖加瓦
外源性装载则是在外泌体分离后，通过物理或化学方法将药物或生物分子装载到外泌体中。这种方法的优点是操作相对简单，适用范围广。常见的外源性装载方法包括被动装载（如孵育）和主动装载（如超声、电穿孔等）。被动装载是将外泌体与药物混合，让药物通过扩散进入外泌体内部；而主动装载则通过物理手段暂时破坏外泌体的膜，使药物能够进入其内部。这些方法虽然能够有效提高药物的装载量，但也可能对外泌体的膜结构造成一定损伤，影响其功能。
将外源药物装载到分离后EVs的示意图。预先分离的EVs与不同的治疗剂（包括小分子药物、质粒DNA、RNA、蛋白质或标记染料）一起孵育。药物可以通过多种方法装载到EVs中，包括孵育（a）、超声（b）、电穿孔（c）、挤压（d）、冻融循环（e）、皂化（f）和融合（g）。孵育或机械应力会导致药物分子被动扩散到EVs中，或者形成短暂的孔隙以促进它们进入EVs。
EVs表面修饰的外源性装载
外源性EV表面功能化方法示意图。a) 肽段共轭：EV膜包含在磷脂双层中的跨膜蛋白，整体带有负电荷。与EV跨膜蛋白具有高亲和力的肽段或与低密度脂蛋白（LDL）相连的靶向肽，有助于在EV表面进行靶向肽段的共轭。带正电荷的肽段可以与带负电荷的EVs形成静电相互作用。b) 通过点击化学进行肽段共轭：基于炔烃-叠氮环加成反应的点击化学有助于在EV表面进行肽段或标记染料的共轭。EVs通过化学反应在其膜蛋白末端插入炔烃基团。含有叠氮基团的肽段或标记染料与含有炔烃末端的EVs发生反应，从而在EV表面共轭肽段/染料。c) PEGylation（聚乙二醇化），EVs通过化学反应在其膜蛋白上引入氨基功能团。含有羟基琥珀酰亚胺酯的聚乙二醇（PEG）与含有氨基的EVs发生反应，从而在EV表面共轭PEG（PEG化的EVs）。
外源性载药方法效率对比
超声是亲水性药物首选，胆固醇修饰可提升疏水性siRNA载量（80%效率）。
体内工程
在生物体内量身定制外泌体
体内工程是一种更为先进的外泌体工程化策略。通过在生物体内对细胞进行基因或化学修饰，使其分泌的外泌体具有特定的功能。这种方法可以在生物体内直接产生具有治疗效果的外泌体，避免了体外操作可能带来的损伤和污染。例如，通过基因编辑技术，可以使细胞表达特定的蛋白质或核酸，这些蛋白质或核酸随后被整合到外泌体的膜中，从而赋予外泌体特定的靶向性或治疗功能。
体内工程化突破案例。规避体外制备流程（成本↓80%），但人体调控精度仍是挑战。
研究结论
外泌体工程化技术的出现，为药物递送领域带来了革命性的变化。然而，这一领域仍处于发展阶段，面临着诸多挑战。
首先，外泌体的装载效率仍有待提高，目前的装载方法往往只能达到较低的药物装载量，这限制了外泌体在临床应用中的效果。
其次，外泌体的纯化和储存也是一个亟待解决的问题。装载后的外泌体需要去除未结合的药物或生物分子，这可能导致外泌体的损失。
此外，外泌体在储存过程中可能会失去其表面修饰特性，影响其功能。
针对这些问题，个人认为未来的研究可以从以下几个方面入手。
首先，开发新的装载技术，提高外泌体的药物装载量。例如，通过优化基因转染方法或探索新的物理化学手段，提高药物的装载效率。
其次，改进外泌体的纯化和储存技术，减少外泌体的损失，保持其功能稳定性。
最后，深入研究外泌体的生物学特性，探索其在不同疾病中的作用机制，为外泌体工程化提供更多的理论依据。
