从零开始了解什么是外泌体

近年来，细胞外囊泡（EV）研究正加速发展。2011年约有200篇相关论文发表，但2016年一年就有1000篇以上的相关论文发表，论文内容涉及各种生理功能和病理症状。EV大致可分为核内体来源的外泌体和细胞膜来源的微囊泡，但即便是用现在提取精度最高的差速离心法也难以将二者明确分离，所以简单地将10,000×g离心后未沉淀的EV称为Small EV（主要是外泌体）^1）。外泌体是由各种细胞分泌的小型膜囊泡（直径30~100 nm），存在于大多数体液（如血液、尿液、髓液等）和细胞培养液中。外泌体是由脂质双分子层包被的膜囊泡，产生于称为多囊泡胞内体的胞内囊泡中，多囊泡胞内体通过与细胞膜融合将外泌体释放到细胞外。外泌体含核内体来源的蛋白质（例如ESCRTs等）和细胞内运输相关蛋白（例如Rab GTPase等）、以及细胞膜来源蛋白（例如CD63、CD81等）等为代表的各种分泌细胞来源的蛋白和RNA，同时还含分泌细胞的细胞膜来源和内体膜来源的脂质（如胆固醇和鞘磷脂等）^2）。多年来研究人员认为外泌体的作用是参与细胞内废弃物的排放。但是近年来外泌体在生物体内作为运载脂质、蛋白质、RNA等细胞间信息传递的新型媒介倍受瞩目。除了阐明外泌体生理或病理功能外，面向于临床应用的功能研究也迅速发展，尤其是诊断、治疗和生物标记物开发等。

现在，外泌体研究横跨几乎所有的研究领域（免疫、神经系统、肿瘤、内分泌、循环系统等）。例如，免疫细胞来源的外泌体含有抗原肽/MHC复合体和各种抗原，可能控制着免疫细胞间抗原信息的交换、免疫细胞活化、非活化等各种免疫应答机制^3）。外泌体在神经系统中与神经回路的控制相关^4），同时各种神经退行性疾病的致病蛋白还可以通过外泌体释放到细胞外并传递到其他细胞，与病情发展密切相关^5）。癌细胞释放的外泌体含有大量与血管新生和免疫抑制相关的分子，构建适合癌细胞生长的微环境，促进癌细胞的发展^6）。另外，癌细胞来源的外泌体上的粘着分子表达形式决定着癌症向器官的转移途径^7）。最近，有报告指出脂肪细胞释放的外泌体对肝脏的遗传基因表达有控制作用^8）。许多病毒利用外泌体的产生路径感染细胞，受病毒感染的细菌和寄生虫通过外泌体控制其他受细胞感染的细菌、寄生虫的活动^9、10）。

上述这些功能几乎都是通过细胞分泌到外泌体中的分子引起的。其中，自从在外泌体内发现分泌细胞来源的mRNA和miRNA后，外泌体参与细胞间基因表达信息的水平转移的可能性备受瞩目^11）。这些RNA被外泌体的脂质双分子层膜所保护，不会被RNase所降解，可以在血液和体液中稳定存在。被靶细胞吞噬的外泌体通过与内体膜融合，将RNA释放到靶细胞的细胞质中。释放出来的mRNA除了被翻译为蛋白质，还通过miRNA抑制靶基因的翻译，使得外泌体在靶细胞内调控基因表达。一个外泌体所含的蛋白质有数万种，mRNA、miRNA的种类有数千种以上，这些分子的组成因来源细胞的不同而异，也会根据细胞的状态而变化。另外，外泌体中这些物质的结构与它们在分泌细胞内的结构不同，所以可能存在一种外泌体特异蛋白和mRNA/miRNA选择性积累的机制。这种特异性可将外泌体内的RNA作为生物标记，更进一步作为治疗开发的靶点。外泌体中的mRNA一旦被靶细胞吞噬，可能会引发该细胞内的功能性蛋白的表达，但外泌体中大部分的miRNA是前体而非功能性miRNA，这些miRNA具有何种生理性意义，学者们还在积极研究。由于外泌体含有各种蛋白质、RNA和脂质，研究人员正将其按细胞进行分类汇总，以建立数据库⸺ExoCarta。此外，在世界各地分别运用蛋白质组学、转录组学和系统生物学进行大规模分析工作，而FunRich的EVplugin已成为一种通用的分析手段。今后，在推进外泌体研究方面，各个研究领域的信息共享至关重要。

近年来，随着外泌体的功能逐渐阐明，越来越多的研究着眼于开发运用外泌体功能的治疗方法。例如，血液中的成纤维细胞（间充质祖细胞的一种）所释放的外泌体，可以通过促进角质细胞的迁移、增殖和血管新生来促进伤口愈合。报告指出，外泌体内的促血管生成miRNA、抗炎性miRNA和促胶原蛋白沉淀miRNA等参与了上述过程^12）。从癌症患者树突状细胞中释放的外泌体含有各种癌症细胞来源的蛋白质，可以强化杀伤性T细胞对癌症细胞的特异性反应。利用此功能的抗肿瘤免疫疗法，目前正处于初期临床研究阶段^13）。另一方面，也有研究尝试利用外泌体的功能抑制发病机制。例如，类风湿关节炎患者的滑膜成纤维细胞所释放的外泌体，聚集了高浓度诱导细胞死亡的TNF-α，可使类风湿关节炎恶化^14）。通过上述介绍可以知道癌症细胞来源的外泌体含有与癌症进展相关的分子，神经细胞来源的外泌体含有与神经退行性疾病相关的分子，因此通过抑制或去除这些外泌体，有望抑制疾病发生。随着研究的不断发展，还会扩大外泌体的功能阐明和临床应用的适应性，有望将外泌体应用于各种疾病的治疗。此外，还可尝试利用外泌体将siRNA和抗癌药剂等运输到目标细胞中。将各种细胞粘着分子表达在外泌体膜表面上，由其形式决定外泌体被运往哪一种细胞，该特性有望用于开发新型DDS^15）。外泌体在体液中十分稳定，同时外囊泡所含的蛋白质和RNA被外泌体的脂质双分子层膜所包被而免于降解。另外从收集后长期储存的体液中所提取到的外泌体仍然比较完整，因此外泌体有望成为临床检测的新型疾病生物标记。外泌体与各种疾病的相关性已经查明，特别是释放到血液中的癌细胞来源的外泌体，与健康细胞来源外泌体和组成分子的差异性备受瞩目，并作为癌症早期的诊断工具，被研究其与癌症发展的相关性^16）。此外，尿液中的外泌体有望作为肾脏、前列腺疾病和膀胱疾病的新型诊断标记，脑脊液中的外泌体作为脑部肿瘤和神经退行性疾病的新型标记。

尽管目前已有许多关于外泌体作用的报导，但是在这些验证实验中使用了从体液和培养细胞上清中纯化的高浓缩外泌体，所以可能无法反映它们在活体内的真实性状。因此，目前尚未阐明该现象是否在活体内真实发生了。确认外泌体生理作用的唯一方法就是明确外泌体的释放机制，通过促进或抑制释放机制，分析会引起何种生理现象，这也是进一步研究发展的方向。甚至生物体内的外泌体动态（哪个外泌体迁移至何处）也会在今后的研究开发中成为重要的研究课题。

截止目前为止，外泌体纯化的方法主要有超速离心法和PEG沉淀法，但利用这些方法提取的外泌体中混有非常多的杂质，必须慎重分析所获得的实验结果是否是由外泌体组成成分所引起的。并且超离法存在操作繁杂、回收率不稳定、不能用于定量分析、必须使用昂贵的超速离心机、无法进行多样品分析检测等问题，因此外泌体的研究相对困难，需要尽快开发可简单纯化高纯度外泌体的技术。因此FUJIFILM Wako着眼于巨噬细胞的外泌体受体Tim4，制备出Tim4细胞外域与磁珠结合的“Tim4磁珠”^17）。由于Tim4以钙离子依赖性方式与外泌体膜表面的磷脂酰丝氨酸（PS）结合，因此用含有螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）的洗脱缓冲液可将结合的外泌体释放出来，从而获得高纯度的完整外泌体。实际上，用Tim4亲和法纯化的人白血病细胞释放的外泌体，其纯度与超离法和PEG沉淀法纯化的外泌体相比，可检测出10~100倍以上的外泌体特异性蛋白，并且几乎没有外泌体以外的杂质，由此证明通过该方法可以重复性良好地纯化高纯度外泌体。因此，该方法可以检测大量目前为止无法检测的外泌体上的蛋白和RNA。利用Tim4对外泌体的强结合能力，可用ELISA或FACS高灵敏度检测和定量外泌体。此外，以往只能用差速离心法粗略纯化的微囊泡，通过运用Tim4亲和法，可实现高纯度纯化微囊泡。本指导书中对这些技术进行了详细说明，我们期待这项技术的有效性受到世界各方好评，并有望贡献于外泌体和微囊泡的生理功能的分析研究。

外泌体的检测和分离的难点，以及外泌体的分类方法多样，导致研究人员尚未统一定义以何种方法纯化的细胞外囊泡可以称为“外泌体”，如何进行实验数据的解释和再现性的确认是一项难题。近年随着国际细胞外囊泡协会（ISEV）的设立、世界性研究者研讨会的形成，国际标准的MISEV指南的提案，计划进行和开始进行EV研究的研究人员请务必阅读这些方针^18、19）。另外为了规避上述的混乱情况，还建立了记录各论文实验条件的EV-TRACK knowledge database^20）。一方面随着EV研究倍受瞩目，各国也启动了大型研究项目。美国启动NIH战略性大型项目Extracellular RNA Communication，国际权威性会议⸺Gordon会议和Keystone Symposia也于2016成立小组会。受欧洲药物研究开发公司“创新药物倡议组织（IMI）”的支持推进的CANCER-ID项目也包含了EV研究。2017年日本选定了EV研究为文部科学省研究开发战略的目标之一，期待会加速研究发展。无论如何，未来EV研究的发展，需开发可成为其研究基础的稳定的研究方法和技术，期望Tim4亲和法可成为其中之一。