【热点研究】外泌体提取、鉴定及标记
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2026-02-11 13:37:01
Exosome（外泌体）是由活细胞分泌的直径约为30-150 nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构；参与细胞之间的交流，物质的运输以及正常生理过程的维持，此外还与疾病的产生有关。
由于外泌体能够透过血脑屏障（BBB）改善神经细胞功能，具有治疗神经系统相关疾病的潜能。
已有研究发现，巨噬细胞外泌体可以用于脑中风的治疗。下面就外泌体的分离、鉴定及标记做简单介绍。
1、超速离心法：目前外泌体分离的金标准，且为外泌体提取的最常用方法，方法成熟，适用于大体积样本。
3、超滤法：操作简单省时，可在低转速下得到外泌体，不影响外泌体的生物活性。
4、亲和层析法：保证外泌体形态完整，特异性高，操作简单，无需特殊昂贵的仪器设备。
上述几种方法，超速离心法、沉淀法、超滤法提取的纯度不够，亲和层析法提取的量不够，我们可以将这两组方法综合起来，先用超速离心法、沉淀法、超滤法粗略提取外泌体，再用亲和层析法提纯外泌体。
据国际细胞外囊泡学会（ISEV）在2014年的提议，外泌体鉴定3个标志：透射电镜（transmission electron microscope，TEM）、粒径（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）、蛋白标志物（Western Blot, WB）。
外泌体透射电镜分辨率为0.1~0.2nm，适合外泌体双层囊膜超微结构观察，可观测样本中是否存在外泌体样结构，通常为茶托型或一侧凹陷的半球形，如图1，同时可测量外泌体大小。
2、外泌体粒径及浓度检测-纳米颗粒示踪技术 NTA：
该方法能保证外泌体原始状态、检测速度快，检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。
外泌体阳性蛋白Top5为跨膜蛋白CD63、CD9、CD81，以及溶质蛋白TSG101、Alix。
外泌体阴性蛋白Top3为内质网蛋白Calnexin、细胞核蛋白histone 3以及高尔基体蛋白GM130。
1、亲脂性染料: PKH-67（green）/PKH-26（red）
染料可以稳定地与细胞膜脂质区结合并发出荧光，主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究以及体内外的细胞失踪研究。PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。相比于PKH-67，PKH-26具有更长的半衰期，标记在兔红细胞上的PKH26半衰期长达100天以上。特别适用于体外增殖研究以及长期的体内细胞跟踪研究。
2、亲脂性羰花青染料（carbocyanine dyes）:DiI/DiD/DiO/DiR
DiI,DiO,DiD,DiR是亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。这些染料在进入细胞膜之前荧光非常弱，当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强。且具有消光系数高、极性依赖性、激发态寿命短等特点。进入细胞膜后，可在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。
3、渗透型的化合物标记法：CFSE/CFDA/Calcein-AM
CFSE可被动扩散进入细胞，这种试剂没有颜色和荧光，直至细胞内的酯酶去除其醋酸盐基团，产生能发出明亮荧光的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。琥珀酰亚胺酯与细胞内氨基反应，形成稳定且能用醛固定剂固定的荧光偶联物。
在Calcein的基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。
此外还有使用放射性标记物，量子点微囊泡标记法来标记外泌体已达到体内追踪外泌体成像。
参考文献：Jiang Y, Wang F, Wang K, Zhong Y, Wei X, Wang Q, Zhang H. Engineered Exosomes: A Promising Drug Delivery Strategy for Brain Diseases. Curr Med Chem. 2022;29(17):3111-3124.
