顶刊常客「外泌体」：形成机制/分离鉴定方法/研究进展/实际应用
近几年，有关外泌体载药、诊断、免疫疗法等方向的文频频续登上各大顶级期刊上，外泌体俨然成为生命科学/基础医学研究的一大热点。
本篇文章将围绕外泌体的形成、分离鉴定方法、研究进展、实际应用等内容展开，Let's学习！
Part.1
外泌体的形成及构成
1）什么是外泌体？
外泌体（Exosome）是细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EV）的一种 ，是由脂质双分子层包裹的微小囊泡 ，直径一般为40-100nm（不同文章中对外泌体直径的定义有所不同 ，30-200nm是个较大区间，40-100nm是一个常用范围） 。
外泌体的膜主要由脂质和蛋白质组成，其内容物包括：
a. 四分子交联体家族成员9（CD49d, CD106）
b. microRNA (miR200, miR105)
c. 酶类（ATPase, pgk1）
d. 转录因子
e. 黏附分子（integrin: 整合素）
f. 脂质筏（cholesterol: 胆固醇）
g. 细胞骨架蛋白（Actin）
h. mRNA and DNA
i. 膜转运蛋白（Annexin, RabGTPase）
j. 受体
k. 热休克蛋白（HSP90）
l. 病毒
2）外泌体的形成过程
首先由细胞质的质膜的第一次内陷形成了一个杯状或茶托状结构；
在这种情况下导致了早期分选内涵体( early-sorting endosome，ESE)的从头形成，在某些情况下可能直接与已存在的ESE合并，另外反式高尔基体网络和内质网也有助于ESE的形成；
ESEs可以成熟为晚期分选内涵体( late-sorting endosome，LSEs)，并最终产生多囊泡内体(multivesicular endosomes，MVBs)；
MVBs既可以与溶酶体或自噬体融合，然后被降解；也可以与质膜融合，释放出所包含的ILVs作为外泌体。
3）外泌体的蛋白分类
外泌体中的蛋白可分为膜蛋白与膜内蛋2大类：
①膜蛋白：
膜蛋白主要分2类，一类是几乎所有外泌体均含有的蛋白，这类蛋白可作为外泌体区别于其他囊泡（EVs）的标志物如四跨膜蛋白（CD9，CD63，CD81，CD326）等；
另一类是特异性膜蛋白，特定细胞分泌的外泌体上特有的，如A33（结肠上皮细胞来源）、MHC-Ⅱ、CD86(抗原提呈细胞来源-T细胞) 、乳凝集素（不成熟的树突状细胞），这些膜蛋白主要用于分离外泌体或分离来源于特定细胞的外泌体。
②膜内蛋白：
主要包括热休克蛋白家族（(HSP60, HSP70, HSPA5, CCT2 和HSP90)、代谢类的酶（GAPDH,烯醇化酶 1, 醛缩酶 1, PKM2, PGK1）、核糖体蛋白（RPS3）、信号转导因子（黑色素瘤分化相关因子, ARF1, CDC42, ）粘附因子（MFGE8、整合素）、细胞骨架蛋白以及泛素等。
其中CD9，CD63，CD81以及TSG101、HSP70、ALix是最常用到的细胞外囊泡鉴定标志物。
标志物蛋白主要涉及到囊泡的形成与分泌过程，产生于细胞中，定位于胞内的膜结构附近。如四跨膜蛋白直接参与了细胞外囊泡内容物的分选；TSG101是ESCRT（内吞体转运复合体）相关的蛋白，而ESCRT复合体是膜形成和断裂的驱动器；ALix直接涉及到了膜泡在形成过程中切割脱离，质膜形成独立膜结构的过程。
Part.2
外泌体提取常见方法
目前人们常用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀等方法实现外泌体的提取分离。
①差速超速离心法：
超速离心是分离细菌、病毒、细胞器等小颗粒的最佳工艺，因此，超离心法很容易转化为外泌体分离。超速离心是利用离心力从300g到100,000g的多个离心循环来实现的，每离心一步后，除去细胞、细胞碎片、凋亡小体等杂质，最后获得较纯的外泌体。目前，超速离心仍被称为外泌体分离方法的「金标准」。
但是，「金标准」也并不是十全十美，细胞外囊泡具有高度的异质性，在一定的离心力下，所有具有密度、大小和质量达到一定阈值的组分（包括外泌体、微泡、蛋白质和脂蛋白等）均可在管底部析出。
优点：低成本，纯度高，适合制备较大体积样本。
缺点：设备要求高，耗时，高强度的离心力可能对外泌体造成机械损伤，容易造成脂蛋白等聚集。
②梯度超速离心法：
(A) 密度梯度超离心法是通过在从底部到顶部逐渐降低的层中添加介质（蔗糖或碘克沙醇）来制备的。长时间离心后，细胞外成分包括外泌体、凋亡小体和蛋白聚集物在密度相近的培养基中达到静止位置。但是，由于等密度梯度超离心仅依赖于样品中不同溶质之间的密度差，所以该方法不能分离与外泌体具有类似密度的物质 (如微泡)。
(B) 移动梯度超离心法通常包括两个梯度介质段。最上层是密度低于样品所有溶质的介质。底部是高密度的垫子。由于溶质的密度都大于梯度介质的密度，离心后，不仅根据密度，还可根据质量/大小，将所有溶质依次分离，从而可以分离密度相似但大小不一的囊泡。
优点：获得的外泌体纯度高。
缺点：样本处理量低，设备要求高，耗时，高强度的离心力可能对外泌体造成机械损伤。
③超滤法：
（A）微型串联超滤器：样本通过串联配置的微滤器，其尺寸排阻极限在20-200 nm左右。当穿过两个膜时，包括细胞碎片，凋亡小体和大部分微囊的大囊泡被捕获在200 nm膜中, 而直径20至200 nm的囊泡则保留在下部20 nm滤膜上。
（B）连续超滤器：首先将细胞外液通过1000 nm过滤器以除去较大的颗粒（例如细胞或细胞碎片）；然后将滤液通过截留值为500 kD的第二个过滤器，以除去小颗粒，例如游离蛋白。最后，通过200 nm滤光片收集<200 nm的外泌体。
优点：设备成本低，方便快捷。
缺点：垂直的剪切力可引起膜的堵塞。
④切向流过滤：
在切向流过滤期间，进料流平行于膜面流动。所施加的压力使一部分液流根据过滤器的尺寸通过膜。由于膜始终在平行流动力的作用下，可以有效地减少潜在的堵塞。在切向流过滤过程中，将剩余部分重新循环回给料池以进行重复过滤，以确保彻底过滤。
⑤分子排阻色谱法：
当溶液通过由多孔树脂颗粒组成的固定相时，分子可以根据尺寸的大小进行分离（A）。小于固定相孔的颗粒进入孔中以获取更长的传输距离，而无法进入孔的较大颗粒直接在树脂（B）周围移动。这导致具有不同尺寸大小的颗粒表现出不同的保留时间，因此，此方法可使外泌体与其他不同大小的颗粒分离。
优点：外泌体纯度高，方便快捷，能保持外泌体的自然状态，重复性好，可用于大量样本的提取制备。
缺点：设设备成本相对较高，纯化后的外泌体被严重稀释，所以需要额外的外泌体富集方法。
⑥聚合物沉淀法：
在将高亲水性聚合物添加到含外泌体的溶液中后，外泌体周围的水分子被聚合物束缚，降低了外泌体的溶解度并诱导其随后的沉淀。使外泌体在低速离心下可以很容易沉淀。
优点：使用方便，不需要大型设备，适用于小样本和大样本，提取效率高。
缺点：蛋白质聚集物等杂质污染外泌体，需要进一步的纯化。
⑦免疫亲合法：
将识别外泌体膜表面特异性标志物（CD9\CD63\CD81 等）的抗体固定在固体基质上。用抗体偶联的固体基质孵育含外泌体的液体后，可将外泌体富集到此类固体基质上。可以通过洗脱步骤收集游离的外泌体。
优点：适合分离特定来源的外泌体，高纯液，使用方便，无化学污染。
缺点：高成本，样本处理量低，外泌体洗脱步骤可能会破坏原有的外泌体结构。
补充：以上介绍了几种常见的外泌体提取方法，但是由于外泌体和其他细胞囊泡之间的物理和生化特性的相似性，以及外泌体本身的异质性，因此没有一种特定的外泌体分离提取技术适合于所有研究，即使是金标准超速离心法也经常收到蛋白质和脂蛋白的污染。在这种情况下，两种或两种以上技术的联合应用为有效的分离提取外泌体提供了一种可行的策略。
Part.3
外泌体鉴定常见方法
国际细胞外囊泡学会（ISEV）在2014年提议，对于分离获得的外泌体需要从3个层面进行鉴定：
①Western Blot（WB）鉴定外泌体表面标志物；
②透射电镜（TEM）鉴定外泌体形态；
③纳米颗粒示踪分析(NTA)鉴定外泌体大小。
①WB验证：检测外泌体标志蛋白的表达情况
鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定外泌体的标志蛋白是否存在于样品中，外泌体形成于早期胞内体，在内吞体转运复合体（ESCRT）及一些相关蛋白的调控下，早期胞内体发生内出芽形成多个腔内小囊泡，构成多胞体（MVB），MVB 最后在GTPase家族中的RAB酶调解下与细胞膜融合向外界释放囊泡。
外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族（CD63、CD81和CD9)）、热休克蛋白家族（(HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2和HSP90)以及一些细胞特异性的蛋白包括A33（结肠上皮细胞来源）、MHC-II(抗原提呈细胞来源)、CD86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素（不成熟的树突状细胞）。其中CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70、ALIX等，是最常用到的细胞外囊泡标志物。
这些标志物蛋白其实主要是涉及到了囊泡的形成和分泌过程，他们产生于细胞中，定位于胞内的膜结构附近，如四旋蛋白（CD9，CD63和CD81），直接参与了细胞外囊泡内容物的分选；TSG101是ESCRT复合体相关的蛋白，而ESCRT复合体是膜形成和断裂的驱动器。ALIX直接涉及到了膜泡在形成过程中切割脱离质膜形成独立膜结构的过程。
②电镜：分析外泌体的大小/形态等
扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)或透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)等电子显微镜可用于外泌体鉴定。SEM的工作原理是用能量为1~30 KV间的电子束，以光栅状扫描方式照射到被分析试样的表面上，利用入射电子和试样表面物质相互作用所产生的二次电子和背散射电子成像，获得试样表面微观组织结构和形貌的高分辨率信息。由于超高真空技术的发展，场发射电子枪的应用得到普及，现代先进的SEM的分辨率已经达到1 nm左右，足够用来进行外泌体尺寸的测量。
TEM是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像，影像放大、聚焦后在成像器件(如荧光屏、胶片、感光耦合组件)上显示出来。
③NTA：检测外泌体粒径及浓度
在外泌体研究领域，NTA技术已被用作外泌体表征手段之一；相较于其他表征方式，NTA技术的样本处理更简单，更能保证外泌体原始状态，检测速度更快。
大致方法：将收集的外泌体用PBS稀释至106/mL，用1 mL注射器注入纳米颗粒跟踪分析仪(如装有450 nm激光器的Nanosight NS300颗粒粒度分析仪)；激光光束穿过样本室外泌体颗粒，通过装有摄像头的显微镜实现颗粒可视化，捕捉外泌体的布朗运动，利用爱因斯坦方程式根据其运动计算浓度和流体力学直径。
④流式细胞仪检测外泌体的生物标志物
流式细胞仪检测技术比较快速，适合高通量筛选，且可分析颗粒的大小与体积。用外泌体表面特异性标志物相应的抗体进行标记，用流式细胞仪检测其阳性表达，从而验证外泌体。
大致方法：染色后的外泌体溶液加入分支聚乙烯亚胺(PEI)，37 ºC孵育15 min，之后超速离心去除PEI，然后加入金纳米颗粒，轻柔重悬后置于培养箱中60 min，加入别藻蓝蛋白(allophycocyanin, APC)DNA染料，室温孵育15 min后流式细胞仪检测。APC阳性的颗粒即为所需检测的外泌体。
Part.4
外泌体案例解析
1）刺激型外泌体
案例：低氧BMSC衍生的外泌体miRNA通过STAT3诱导的EMT促进肺癌细胞的转移
背景资料与立题依据：
1）循环的miRNA被隔离在外泌体中而丌被降解。
2）外泌体介导的特定miRNA从基质细胞向上皮肿瘤细胞的转移有助于癌症进展。
3）缺氧是实体瘤的一个显著特征，缺氧会促进含有CD63和CD9的外泌体的释放。
4）BMSC促进肺癌细胞肿瘤生长。
5）利用miRNA芯片筛选差异表达的BMSC外泌体miRNA。
6）血浆外泌体miRNA可以作为肺癌转移的生物标志物。
思路参考：
1）miRNA/lncRNA选择：小鼠血浆外泌体miRNA表达谱显示，与单独注射LLC相比，共注射组86个外泌体miRNA显著升高，354个外泌体miRNA显著降低；
2）疾病替换：利用芯片数据筛选相关疾病miRNA/lncRNA，借鉴实验思路；
3）功能变化：根据靶基因功能相关性，重新选择相关功能（巨噬细胞极化、血管形成）。
2）机制研究
案例：lncRNA SBF2-AS1的体外转移增强对替莫唑胺在胶质母细胞瘤中的耐药
背景资料与立题依据：
1）烷基化药物替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是治疗多形性胶质母细胞瘤（GBM）的国际标准化疗药物；
2）lncRNA SBF2-AS1在外泌体中富集，并促进了胶质母细胞瘤的替莫唑胺耐药性；
3）lncRNA在癌细胞和耐药株中高表达，过表达lncRNA 导致TMZ的耐药性，而抑制lncRNA 会使耐药性对TMZ敏感；
4）转录因子与lncRNA启动子区结合，上调lncRNA水平；
5）lncRNA可以在胞质内作为ceRNA调控下游。
思路参考：
1）LncRNA/miRNA上游调控机制研究
转录因子调控LncRNA/miRNA启动子区影响其表达
DNA甲基化激活LncRNA/miRNA转录影响其表达
2）LncRNA/miRNA下游调控机制研究
直接结合靶基因
ceRNA机制
3）泛素化/磷酸化
3）功能研究
案例：胚胎干细胞来源的外泌体具有靶向特性，可作为胶质母细胞瘤治疗的化疗药物递送载体
背景资料与立题依据：
1）胶质母细胞瘤(GBM)是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，死亡率和 致残率均较高。除了耐药性很高，其丌良预后的另一个关键原因是血脑 屏障(BBB)限制了化疗药物到达肿瘤区域。
2）外泌体由于其特殊的表面结构，如四酯酶蛋白和整合素，而表现出内在 的组织或细胞靶向特性。
3）ESCs可以大规模产生具有稳定特性的外泌体(ESC-exos)。
4.）ESC-exos含有反映胚胎微环境含量的物质，这可能是ESCs介导的抗肿 瘤作用的主要效应因素。
5）静脉注射的外泌体主要分布在肝脏或脾脏，并丏极小部分注射的外泌体 保留在大脑或肿瘤部位。
Part.5
外泌体在医疗领域的应用
外泌体在医疗领域应用前景巨大，主要包括疾病诊断、治疗和药物递送这3个方面。
外泌体作为检测试剂
外泌体检测是近几年逐步兴起的方向，外泌体从活体细胞分泌出来，可以携带多种DNA、RNA和蛋白多种成分，在患者血液、尿液、腹水胸水等体液中广泛存在，且能够在低温条件下稳定保存。所以通过外泌体获取携带足够的生物信息相对容易，通过携带肿瘤早期标志物的信息，进而提供早期的诊断机会。
外泌体作为疾病疗法
外泌体介导的细胞通讯比旁分泌信号和内分泌信号等具有优势，因为每个外泌体可能传递不止一条信息，并在基因表达的不同阶段发挥调节作用。以最具应用前景的干细胞外泌体为例，干细胞外泌体介导的细胞通讯参与了许多生理过程，包括免疫调节、肿瘤进展、组织再生、重编程、分化、端粒功能和衰老。也因此被应用到诸如心血管疾病、皮肤疾病、糖尿病、骨关节炎等多种与衰老相关的疾病治疗研究中。
外泌体作为递送载体
外泌体载药治疗也是正在探索的方向，它可以向肿瘤细胞运送组分，影响肿瘤的进展、转移和耐药等行为，也可以将外泌体作为药物递送的媒介，为其构建靶向性，使其用于递送治疗剂，从而扩展现有精准治疗的给药方式。由于外泌体是天然存在的分泌性囊泡，它们在体内普遍存在，进而推断出在体内的耐受性良好。另外，外泌体固有的归巢能力（指自动迁移到受损部分的能力）暗示了它们在药物递送过程中的潜在效力。而且外泌体表上有很多粘附蛋白，在基因治疗领域中成为潜在载体，纳米尺寸和柔韧性使它们能够跨越主要的生物屏障，比如血脑屏障（BBB）等。因此外泌体是最好的药物传递系统选择之一，具极大的应用潜力。
