解密外泌体：结构、作用机制及临床应用前景
摘要
外泌体(exosome)是细胞主动向胞外分泌的大小均一的囊泡样小体，具有抗肿瘤免疫、促血管新生等生理功能。不同类型的细胞可以释放出外泌体，正常生理状态下血液、尿液、乳汁和支气管灌洗液中也能分离到外泌体。本文主要对外泌体的结构、功能和提取方法、外泌体与靶细胞的作用方式进行综述。
引言
外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中，是细胞主动分泌的大小均一，直径为40~100nm，密度1.10~1.18 g/ml的囊泡样小体。1996年Raposo等发现B细胞可以通过释放能表达主要组织相容性复合体(MHC)分子的外泌体促进T细胞增殖和抑制肿瘤生长。外泌体可携带多种蛋白质、mRNA、miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。外泌体有可能成为药物的天然载体，应用于临床治疗。
外泌体与微泡 (microvesicle)
细胞间的相互作用可通过释放蛋白质 、核酸、脂质等分子到胞外，与受体结合从而介导胞内信号转导。除了这些单分子以外，细胞还可以释放膜囊泡，通过水平转移功能性的mRNA、miRNA和蛋白质到受体细胞，改变细胞的功能。外泌体和微泡就是其中的两种，二者在很多情况下被混淆，其主要区别在于形成方式不同。外泌体是目前为止定义最明确的囊泡。细胞内内溶酶体微粒(endolysosomal vesicle)内陷形成多囊泡体(multi-vesicular body)，在刺激作用下，多囊泡体与细胞膜融合，向胞外分泌的大小均一，直径在40~100nm 的囊泡为外泌体。外泌体的形成和释放涉及内吞体分选转运体和一些相关的蛋白质如CD9、CD63。微泡则是细胞出芽与细胞膜融合后直接脱落形成的囊泡，大小不一，直径在50nm~1000nm之间。微泡没有独特的表面标志物，其膜脂质成分、蛋白组成、密度也还需进一步检测。
外泌体的结构
外泌体富含胆固醇和鞘磷脂，是由多囊泡体与细胞膜融合后向胞外分泌的囊泡，具有脂质双分子层结构。几乎所有的外泌体都有微管蛋白、肌动蛋白结合蛋白、四跨膜蛋白。由于其特殊的形成方式，外泌体不含有内质网内的蛋白质，而高表达细胞内源性蛋白质如Alix、Tsg101。不同细胞来源的外泌体蛋白组成存在差异，肠上皮细胞来源的外泌体含有多种代谢酶及肠组织特异性A33抗原，B细胞来源的外泌体富含CD86和MHC分子，T细胞来源的外泌体表面有促凋亡的FasL受体。Théry等[3]通过MALDI-TOF-MS分析树突状细胞 来 源 的 外 泌 体 ， 鉴 定 出 跨 膜 蛋 白 (Mac-1 αchain、MHC-II β chain、CD9)、细胞质蛋白(hsc73、annexin II、Gi2α)，膜外蛋白乳脂肪球上皮生长因子8(milk fat globule-EGF factor 8 protein,MFG-E8)为主要成分。其中hsc73是一种热休克蛋白，可以降低抗肿瘤免疫反应；MFG-E8是膜外糖蛋白，可结合αvβ3和αvβ5整合素(integrin)促进细胞粘附。外泌体内的RNA主要为小RNA，包括miRNA。miRNA不仅仅是遗传信息的内源性调控者，也是调节细胞通讯的分泌因子及疾病的生物标志物。外泌体对靶细胞的调节作用外泌体与靶细胞的识别具有特异性，如血小板来源的外泌体能识别内皮细胞和巨噬细胞，不能识别中性粒细胞；而中性粒细胞来源的外泌体则可识别血小板、巨噬细胞及树突状细胞。外泌体靶向细胞的方式主要有三种：一是直接与靶细胞的胞膜融合，同时释放mRNA、miRNA进入细胞质；二是通过内吞作用被靶细胞摄取；三是识别细胞表面的特异性受体(图1)。外泌体上的C反应凝集素(C-type lectin)与树突状细胞表面的C反应凝集素受体(CLR)的结合是钙依赖性的，在树突状细胞的培养液中加入EDTA会明显抑制外泌体的摄入，证实树突状细胞摄取外泌体可通过C-type lectin/CLR介导；MFG-E8可通过其RGD结构域结合树突状细胞和巨噬细胞表面表达的整合素，是外泌体与抗原提呈细胞识别的主要途径。外泌体可通过磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)识别单核细胞膜表面的受体(PSR)，诱导胆固醇堆积，这个作用可以被抗磷脂酰丝氨酸受体抗体抑制。外泌体表面有多种生长因子、细胞因子(如VEGF、SCF)，并且几乎所有的外泌体内都含有生理活性的脂质成分如1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate , S1P)、神经酰胺-1-磷酸(ceramide-1-phosphate, C1P)。外泌体进入靶细胞后，这些旁分泌因子直接与细胞相互作用，如S1P、C1P可抑制细胞凋亡和刺激血管新生。此外，外泌体还可水平转移miRNA至受体细胞，miRNA作为信号分子直接传达遗传信息，调节细胞功能。例如，巨噬细胞在受到刺激后会增加外泌体中miR-150的分泌，miR-150可通过抑制内皮细胞(HMVEC)中miR-150靶基因c-Myb 的翻译来刺激内皮细胞迁移。
外泌体的提取及方法学评价
到目前为止，仍没有一种方法能同时保证外泌体的含量、纯度、生物活性。
4.1 离心法
这是目前外泌体提取最常用的方法。简单来说，收集细胞培养液以后依次在300g、2 000g、10 000g离心去除细胞碎片和大分子蛋白质，最后100 000g离心得到外泌体。此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体。
4.2 过滤离心
过滤离心是利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜离心分离外泌体。截留相对分子质量是指能自由通过某种有孔材料的分子中最大分子的相对分子质量。外泌体是一个囊状小体，相对分子质量大于一般蛋白质，因此选择不同大小的MWCO膜可使外泌体与其他大分子物质分离。这种操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度不足的问题。
4.3 密度梯度离心法
密度梯度离心是将样本和梯度材料一起超速离心，样品中的不同组分沉降到各自的等密度区，分为连续和不连续梯度离心法。用于密度梯度离心法的介质要求对细胞无毒，在高浓度时粘度不高且易将pH调至中性。实验中常用蔗糖密度梯度离心法，在4.1的基础上，预先将两种浓度蔗糖溶液(如2.5M 和0.25M)配成连续梯度体系置于超速离心管中，样本铺在蔗糖溶液上，100 000 g离心16h，外泌体会沉降到等密度区(1.10~1.18g/ml)。用此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，量少。
4.4 免疫磁珠法
免疫磁珠是包被有单克隆抗体的球型磁性微粒，可特异性地与靶物质结合。同样，在4.1的基础上，预先使磁珠包被针对外泌体相关抗原的抗体(如CD9、CD63、Alix)与外泌体共同孵育，蒸馏水冲洗后，重悬于PBS缓冲液中。这种方法可以保证外泌体形态的完整，特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备, 但是非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不便进行下一步的实验。
4.5 色谱法
色谱法是利用根据凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系而对溶质进行分离的分析的方法。样品中大分子不能进入凝胶孔，只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，首先被流动相洗脱出来；小分子可进入凝胶中绝大部分孔洞，在柱中受到更强地滞留，更慢地被洗脱出。分离到的外泌体在电镜下大小均一，但是需要特殊的设备，应用不广泛。
外泌体的功能及与临床的关系
5.1 外泌体的免疫功能
1998年Zitvogel等发现树突状细胞分泌的外泌体在小鼠体内可以引起肿瘤排斥，自此许多研究便集中于外泌体的抗肿瘤免疫作用，并且开展了外泌体相关的临床试验(NCT01344109、NCT01159288、NCT01550523)，在网站http://www.clinicaltrials.gov都有备案。外泌体对肿瘤生长的影响可体现在其抗肿瘤免疫、免疫功能抑制和肿瘤免疫逃逸方面。携带肿瘤抗原的外泌体可将其表面的MHC抗原肽复合物传递给树突状细胞，增强抗肿瘤免疫。肿瘤细胞来源的外泌体可通过表达FasL诱导CD8+ T细胞凋亡，导致肿瘤免疫逃逸；减少树突状细胞的分化、促进骨髓来源的免疫抑制细胞(MDSC)分化、通过NK细胞激活型受体(NKG2D)抑制T细胞和NK细胞的细胞毒性影响宿主的免疫系统。耐受性树突状细胞(tDC)来源的外泌体(tDex)与tDC具有相似的诱导免疫耐受特性，将tDex输注免疫介导型再生障碍性贫血小鼠体内，可促进小鼠造血功能的恢复。Hart发现，在大鼠骨髓移植前注射供体骨髓树突状细胞分泌的外泌体给受体，受体心脏存活时间延长，提示存在免疫耐受现象。此外，HSP70+人结肠癌细胞来源的外泌体在体外可刺激NK细胞直接杀伤肿瘤细胞。国内研究发现，与结肠癌细胞相比，癌细胞分泌的外泌体能更好地促进外周血单个核细胞(PBMC)的增殖，而热休克处理外泌体可增加外泌体的免疫原性，更好地促进外周血单个核细胞增殖。肿瘤来源的外泌体在中低剂量时表现出对肿瘤细胞的促增殖作用，在高剂量时则表现为抑制作用。因此外泌体对肿瘤微环境的影响可能还与外泌体的剂量有关。
5.2 外泌体中 miRNA 的功能
外泌体来源的miRNA和其他信号分子一样，调节着生物信号网络，参与多种生理过程。间充质干细胞(MSC)来源的外泌体通过转移miR-133b到神经细胞，可促进神经轴突的生长；血管新生是内皮细胞发生增殖和游走形成小血管的过程，K562细胞来源的外泌体miR-92可促进人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)细胞的游走和管状结构形成，从而促进血管新生；缺氧可上调miR-17超家族，在缺氧诱导的小鼠肺动脉高压模型中观察到间充质干细胞移植可抑制肺炎性反应、血管重塑及右心衰竭，研究其旁分泌机制发现间充质干细胞来源的外泌体可抑制miR-17超家族从而逆转肺动脉高压。大量研究表明干细胞可分泌外泌体，骨髓间充质干细胞来源的外泌体可减少心肌缺血再灌注损伤，并且已有实验证实外泌体的miRNA可以促进血管新生，因此外泌体可能成为治疗心血管疾病的一个新方向。
5.3 外泌体的临床应用
目前，外泌体的研究逐步用于临床。Keller等通过RT-PCR分析羊水中的外泌体，发现外泌体存在编码ZFY(人类Y染色体的性别决定区编码一种锌指蛋白)的mRNA，可用于胎儿性别的判断。外泌体miRNA可作为肺癌的诊断标志物，Taylor等发现卵巢癌患者与正常人血液外泌体的miRNA图谱有明显差异，说明外泌体有助于卵巢癌的诊断。此外分析尿样本中外泌体的蛋白图谱还可能协助肾脏疾病的诊断(表1) 。外泌体作为生物标志物虽然还处于起步阶段，但随着进一步的研究，外泌体的临床应用可能会有良好的前景。
结语
长期以来，对于外泌体的研究主要集中在研制具有特定靶向的抗肿瘤疫苗。但其抗肿瘤作用具体是增强免疫还是引起耐受，是促进增殖还是诱发凋亡，其内在的机制仍需深层次探讨。外泌体包含多种蛋白质和遗传物质，表明蛋白质等大分子物质可以装载到外泌体上。外泌体可广泛分布于不同体液，在体内有较长的半衰期。此外，外泌体可以穿透细胞膜释放mRNA到靶细胞，使受体细胞翻译转染的mRNA。因此，外泌体可能成为理想的药物载体，利用电穿孔或脂质体转染的方式直接把药物转入外泌体或者将编码兴趣蛋白质的基因转入分泌外泌体的细胞。但是目前外泌体作为药物载体仅限于理论层面，是否可行还有待研究。总而言之，随着对外泌体认识的加深，外泌体可能会成为临床的“新宠”，协助疾病诊断及治疗。
