新一代药物递送载体---外泌体
外泌体是最小的细胞外囊泡（EV），其直径范围为 30-100 nm，来源于内体【1】。外泌体具有与细胞相似的表面形态。这些小小的外泌体并不简单，它们携带着各种生物分子——蛋白质、核酸和脂质，可充当细胞之间的信号转导通道，这使得外泌体成为一种有吸引力的药物输送载体。
在药物递送载体应用方向，外泌体具有许多优点，例如与有机体组织的高相容性，低毒性，半衰期长，非免疫原性和对各种细胞的靶向性好等。目前，基于外泌体的药物递送系统仍处于研究和临床试验的早期阶段【2】。在本文中，我们概述了有关外泌体生成的生物学过程，以及外泌体的扩增和分离纯化常用技术，最后介绍了外泌体作为药物载体的临床应用研究、存在的挑战及展望。
外泌体简介
最初，当首次发现细胞外囊泡（EV）时，这些微囊泡与外泌体一起被视为细胞废物或细胞的副产物/碎片。其中，外泌体囊泡于 1983 年首次被发现，经过随后的进一步研究发现其为一些细胞的功能性分泌物，从而抛弃了外泌体囊泡是细胞废物或细胞副产物的观点【3，4】。
几乎所有类型的细胞均可分泌 EV，根据其结构、大小和来源，主要分为外泌体、微囊泡（MV）和凋亡小体等。细胞膜上的囊泡可融合产生内体（endosome），内体进一步发展为多泡体（MVB）。合成的 MVB 有两个主要作用，即参与细胞内蛋白质降解和作为外泌体合成过程的中间体。虽然决定 MVB 上述命运的因素尚不清楚，但一些研究表明，特定 MVB 的命运取决于 MVB 的胆固醇含量，胆固醇水平较高的 MVB 倾向于进一步分泌，胆固醇含量低的 MVB 倾向于被送去溶酶体进行降解。与其他主要由细胞膜“出芽”形成的囊泡的产生不同，外泌体的生物合成涉及更多的复杂性。它包括 MVB 的反向膜包覆和分配，导致外泌体释放到细胞间液中。因此，外泌体被认为是在质膜融合 MVB 分泌时分泌的【7】。
如上所述，外泌体来源于 MVB，具有富含不饱和脂肪酸、磷脂酰丝氨酸、聚甘油、鞘磷脂、胆固醇和神经节苷脂的脂质双层，外泌体的脂质双层为外泌体提供了一定强度的有力屏障，为其装载的分子提供了稳定的内环境，阻止其在胞内被酶解【8】。研究表明，外泌体已成为细胞间通讯的关键介质之一，可将复杂的蛋白质、脂质和核酸从母细胞运送到临近或远处的细胞【9，10】。到达受体细胞后，它们通过表面配体或搭载的囊泡内活性物质来调节受体细胞的生理功能，在信号转导、细胞增殖分化、免疫反应等多种生理过程中起着不同的作用。此外，由于外泌体起源于内体，外泌体成分会明显地带有来源细胞的内体成分，例如“特定的生物标志物”（CD63，CD9 和 CD81）等，还携带来自亲本细胞的基因等核酸成分，如 microRNA、长非编码 RNA 和环状 RNA。因此，外泌体在身体的多种生理和病理状态中起着至关重要的作用，且可以用作生物标志物【11】。
外泌体的扩增和分离
目前外泌体的分离纯化技术包括超速离心、超滤、免疫分离、体积排阻色谱（SEC）、基于聚合物的沉淀、磁分离等。其中，超速离心已广泛用于外泌体提取，是外泌体分离的“金标准”。超速离心法分离外泌体的基本原理是由于样本中存在的颗粒沉降系数不同，这导致它们沉降聚集在不同分离层中，超速离心法具有高通量等优点【12】。
不久前，Pascal Rowart 等人报道了一种通过结合高速和超速离心机从脂肪源性干细胞中快速扩增、高效分离外泌体的方法。使用配备 BioBLU 0.3c 一次性生物反应罐体的 DASbox 迷你平行生物反应器系统，利用微载体悬浮培养人源脂肪干细胞（hADSC），然后使用 CR22N 高速离心机和 CP100NX 超速离心机完成外泌体分离。这套工作流程能够增加高活力细胞产量，并且产生大量的高质量外泌体，并将外泌体分离时间缩短到 4 小时以内，快于沉淀或过滤等其他分离方法【13】。
外泌体作为药物递送载体
目前，有多种聚合物材料，脂质体和纳米材料被用作药物输送载体。然而，这些材料与宿主组织细胞的相容性等问题仍然是其作为药物递送载体面临的挑战。鉴于外泌体具有良好的生物相容性，靶标特异性和在机体内的半衰期长等优点，外泌体在药物递送载体方向的应用受到越来越多药物递送系统开发人员的青睐。
研究显示，经工程化修饰的外泌体可比正常细胞更倾向于在癌组织中积累，这使得外泌体成为用作抗癌药物载体的首选。Gomari 等人表明，基因工程修饰后可靶向 HER2 的外泌体优先被乳腺癌（HER2+）细胞吸收。另一方面，非靶向 HER2 的外泌体与 HER2 + 细胞的结合可以忽略不计【14】。
目前，科研人员对外泌体的表面进行多种工程化修饰，使其具有高度的靶向特异性。在 Tian 等人的一项研究中，在老鼠模型中，（cRGDyK）肽与外泌体偶联以用于缺血性脑损伤的靶向治疗，该研究为设计工程化修饰的外泌体特异性靶向缺血性脑病变区域提供了一种策略【15】。在 Warren MR 等人一项研究中，通过添加 PEG 的亲水表面涂层，增强了牛乳源外泌体负载 siRNA 的能力，且研究表明，聚乙二醇化外泌体在酸性胃肠环境中表现出更好的穿透性和稳定性【16】。
此外，乳源性外泌体（mExosomes）是十分经济和非常有前途的药物输送系统之一，牛奶是一种易于且可以大量获取的原料。一项研究显示，包裹姜黄素的 mExosomes 表现出相对增强的抗炎和抗肿瘤活性。这项研究还表明，含有姜黄素的 mExosomes 比游离姜黄素具有更高的生物利用度【17】。
展望
当下，外泌体被认为是极具潜力的药物输送系统之一，然而，人们目前对外泌体的认识还不足，需要继续加大其基础研究与外泌体制备工艺科研方面的投入，另外，外泌体的分离纯化、质检、长期存储等工艺仍旧面临着不小的挑战，例如：
① 现有的外泌体分离方法的效率低，导致其产量低，并且放大生产的成本很高；
② 由于外泌体的大小、组成、功能和细胞起源不同，外泌体的异质性增加了其表征的复杂性；
③ 目前外泌体最稳定的储存条件（温度或 pH 值）仍然没有完全确定，且负载或包裹药物会使外泌体制剂的稳定性进一步复杂化。
要高效地推进外泌体载体进入临床阶段，外泌体制剂必须遵守 GMP 法规，需要为从不同来源分离的外泌体建立标准方案，以防止批次间的差异并产生可重复性，其中包括质量控制方案、标准细胞培养技术、下游分离技术标准和外泌体来源等等。因此，必须做出较大地努力来解决技术和监管方面的问题，以加快基于外泌体疗法的有效临床转化。
参考资料：
1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7099650/
2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9658823/
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9. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19383393/
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12. Momen-Heravi, F.; Balaj, L.; Alian, S.; Mantel, P.-Y.; Halleck, A.E.; Trachtenberg, A.J.; Soria, C.E.; Oquin, S.; Bonebreak, C.M.; Saracoglu, E. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biol. Chem. 2013, 394, 1253–1262.
13. https://www.eppendorf.com/product-media/doc/en/8894908/Fermentors-Bioreactors_Application-Note_476_DASbox-Mini-Bioreactor-System-High-Speed-Centrifuge-CR22N-Ultracentrifuge-CP100NX_Fast-Efficient-Isolation-Exosomes-Stem-CellsCombination-Singl.pdf
14. Gomari, H.; Forouzandeh Moghadam, M.; Soleimani, M.J.O. Targeted cancer therapy using engineered exosome as a natural drug delivery vehicle. OncoTargets Ther. 2018, 11, 5753–5762.
15. Tian, T.; Zhang, H. Surface functionalized exosomes as targeted drug delivery vehicles for cerebral ischemia therapy. Biomaterials 2018, 150, 137–149.
16. Warren MR, Zhang C, Vedadghavami A, Bokvist K, Dhal PK, Bajpayee AG. Milk exosomes with enhanced mucus penetrability for oral delivery of siRNA. Biomater Sci (2021) 9:4260–77.
17. https://link.springer.com/article/10.1208/s12248-017-0154-9
