外泌体：其分类、分离技术、储存、诊断和靶向治疗应用综述

介绍

外泌体（exosome）是由细胞分泌出来的生物纳米级球形脂质双层囊泡，直径约40~100nm，以1.13~1.19g·mL−1的密度漂浮^{于蔗糖密度梯度溶液中。1~ 5} 1981^年Trams等⁶将来源于质膜的囊泡统称为外泌体，并首次提出“外泌体”的概念，认为外泌体是一类具有5'-核苷酸酶活性、可能具有生理功能的膜囊泡，来源于各种细胞系培养物的渗出物。目前定义的外泌体（40–100nm）于1983年首次在绵羊网织红细胞中发现。7、8  ^Johnstone等^{9在网织红细胞成熟过程中追踪了转铁蛋白受体，发现外泌体的形成是成熟红细胞中转铁蛋白}受体丢失的机制。为了将它们与其他类型的细胞外囊泡（EV）相区别，它们被命名为外泌体。但值得注意的是，即使广泛使用“外泌体”一词，由于分离方法上的困难，根据ISEV 2018指南¹⁰ ，也有人建议用“小细胞外囊泡（sEV）”一词代替。研究发现，外泌体含有核酸、蛋白质、脂质、细胞因子、转录因子受体和其他生物活性物质。^11 , 12其中，外泌体蛋白质组分主要分为两类，一类是公共组分，参与囊泡形成和分泌过程，即外泌体中普遍存在，包括膜转运和融合相关蛋白(如Rab、GTPases)、热休克蛋白(如HSP70、HSP90)、四次跨膜蛋白超家族(如CD63、CD81)、ESCRT复合物相关蛋白(如Tsg101、Alix)、整合素等；另一类是特异组分，与它们的祖细胞关系密切，即具有细胞特异性，如来源于抗原呈递细胞的CD45和MHC-II等。随着外泌体研究的深入，它的应用也越来越广泛，外泌体可以在生理和病理过程中发挥作用，作为细胞间通讯和物质交换的介质。同时，外泌体能够通过多种途径和位点递送多种生物活性物质以及易失活或易降解的成分（指单独给药时在体内滞留时间较短的治疗剂），并安全地转运至靶细胞参与调控，如组织修复、肿瘤诊疗、免疫^{调节等。5,13}在这篇综述中，我们主要关注外泌体的分类、制备和表征、储存稳定性、生物标志物、靶向药物输送系统并提供一些见解。

外泌体的起源和分类

形成

早期内体由细胞膜内陷形成，随后生物活性物质开始在早期分选内体（ESE）中聚集，在内吞分选复合物及其他运输所需的相关蛋白的控制下，早期内体发展成为晚期分选内体（LSE）。LSE最终经过第二次内陷形成多泡体（MVB）。MVB与细胞膜融合后，细胞内的物质以囊泡的形式释放到细胞外，这些囊泡就是外泌体。外泌体的生物来源如图1所示。外泌体的形成机制多种多样，目前对ESCRT依赖性机制和ESCRT非依赖性机制的研究较多。^14 – 16然而，最近有报道称，某些成分，如四跨膜结构域蛋白和脂筏，也参与了一些外泌体的形成。17，18^因此，其确切机制仍然存在争议。

分类

根据外泌体是否经过人工改造，外泌体分为天然外泌体和工程外泌体。天然外泌体又分为动物来源的外泌体和植物来源的外泌体。由于外泌体是在正常和肿瘤条件下产生的，动物来源的外泌体又分为正常外泌体和肿瘤外泌体。

^{几乎所有类型}的正常细胞都能产生外泌体，如人脐静脉内皮细胞、间充质干细胞（MSC）、T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DC）、自然杀伤（NK）细胞等。19 ^– 22例如，间充质干细胞（MSCS）是一种具有自我更新和多向分化能力的多能性干细胞。MSC不仅能适应肿瘤微环境，而且具有强大的旁分泌活性，能分泌大量的外泌体。研究表明，含有紫杉醇（PTX）的外泌体在体外对人胰腺癌细胞系CFPAC-1的增殖有明显的抑制作用，有作为药物载体的潜力。23^此外，MSC外泌体已被证明在许多疾病的发展中发挥作用。它们不仅参与组织修复和损伤的过程，^{24，25对心血管}疾病（如心肌梗死）^26，27和神经系统疾病有一定的治疗作用，^28还可以减轻肝损伤，用于治疗肝脏疾病。29^巨噬细胞是单核吞噬细胞，在炎症、免疫调节、伤口愈合和血管生成中发挥作用。30一般来说，巨噬细胞在体内分布广泛，可以极化为M1或M2巨噬细胞。研究表明，巨噬细胞来源^的外泌体可以通过影响炎症信号和免疫功能来影响肺组织微环境。31此外^， Exo-PTX在Lewis肺癌转移模型中有明显的抗肿瘤作用。通过呼吸途径递送的巨噬细胞来源的外泌体几乎完全与癌细胞的转移共定位，这表明巨噬细胞来源的外泌体可能具有特定的表面蛋白，倾向于优先在癌细胞中聚集，具体机制有待进一步研究。32外泌^体能够从亲本细胞中遗传许多特定的生物分子，这是其异质性的原因之一。33不仅如此，不同来源的外泌体在产量、含量、功能、载药量等方面^也存在一些差异，从而可能产生不同的治疗效果。Kanchanapally 等³⁴采用共培养技术，成功将阿霉素（DOX）负载于胰腺星状细胞（PSC）、胰腺癌细胞（PCC）和巨噬细胞来源的外泌体上。相比之下，PSC来源的外泌体产量最高，载药率也较高，而巨噬细胞来源的外泌体的抗肿瘤活性最强，这表明不同来源外泌体具有特异性。

另外，上文提到的正常外泌体广泛存在于唾液、血浆、尿液、腹水、乳汁和胆汁等体液中。目前，来自乳汁的外泌体已被成功开发用于递送化疗药物紫杉醇，并且其生物利用度、稳定性、安全性和毒性均已通过标准测试。35^同样，存在于体液中的外泌体可以表达一定的诊断和治疗特性。例如，深入研究血液或脑脊液中外泌体中的环状RNA有助于揭示神经精神疾病发展的潜在机制^36。此外，血清外泌体携带的miRNA可用于脊髓损伤（SCI）的诊断和预后³⁷。同样，通过评估子宫内膜癌 (EC) 和疑似患者尿液外泌体中 miRNA 的表达谱，发现差异表达的 miRNA 可用作 EC 诊断的生物标志物^。38

肿瘤细胞能够分泌大量的外泌体，其表面的特异性抗原可以反映供体细胞的性质，因此肿瘤外泌体在癌症研究中引起了极大的关注。肿瘤外泌体不仅在肿瘤生长、转移、免疫调节过程中发挥重要作用^{39，40 ，而且}可以监测疾病的发展⁴¹，并作为疾病的诊断标志物42。^例如，Wu等⁴³研究发现过表达CAPS1的结直肠癌（CRC）细胞来源的外泌体可以增强正常结肠上皮FHC细胞的迁移。因此，抑制肿瘤外泌体的分泌是转移性CRC患者的一种治疗选择。有研究表明，TKI是针对BCR-ABL1 p210癌蛋白的酪氨酸激酶抑制剂，对费城染色体阳性的慢性粒细胞白血病（Ph+CML）有明显的治疗效果。 TKI治疗的CML慢性期患者体内的肿瘤外泌体可以识别目前标准化MRD监测系统无法评估的残留活性白血病细胞的持续存在，可以作为预防未来CML复发的新的监测工具^。41

此外，食物来源的外泌体也具有良好的开发前景。近年来，研究发现植物来源的类外泌体纳米颗粒（ELN）与哺乳动物外泌体具有相似的结构。生姜来源的颗粒可以预防肝脏相关疾病的发展，而源自葡萄、胡萝卜、西柚和生姜的ELN具有抗炎作用，并能维持肠道稳态^{。44 – 47}

目前，外泌体主要根据来源进行分类，但并未详细分析各类外泌体的特性及功能应用。未来可考虑从亲有机性、生物分布和免疫原性等方面进行进一步细分^。29

制备和表征

分离

随着对外泌体研究的深入，其潜在应用价值被不断挖掘，可重复的分离富集外泌体有助于评估其生物学功能。然而，外泌体的大小、含量、功能和来源均存在异质性³³，导致分离困难。此外，目前大多数分离技术不能将外泌体与具有相似生物物理特性的脂蛋白以及来自非内体途径的胞外囊泡完全分离，导致外泌体纯度较低。因此，如何高效富集外泌体是当前的一大难题，这对于外泌体的下游分析至关重要。针对不同的目的和应用，选择不同的分离方法，其中较常用的有超速离心、基于尺寸的分离技术、聚合物沉淀、免疫亲和捕获技术等。

超速离心技术

超速离心（UC）是目前应用最广泛的分离技术，也被称为外泌体提取分离的金标准。UC主要根据原溶液中各组分的大小和密度的差异来收获所需组分，因此适合于沉降系数差异较大的大剂量样品组分的分离。Johnstone^等首先应用此方法从网织红细胞组织培养基中分离外泌体，Thery等对该方法进行了优化。9,49超速离心主要分为^{两步：首先，}一系列连续的低中速离心，去除死细胞、细胞碎片和大尺寸的细胞外囊泡，然后以更高的速度分离外泌体，离心力为100,000×g，用PBS洗涤外泌体，去除污染蛋白等杂质。研究发现，离心时间、离心力、转子类型及参数均影响目标外泌体的产量和纯度。48 ^{, 50该方法无需标记外泌体，可避免交叉污染，但由于其耗时、成本高、易结构破坏、聚集成块}、易与脂蛋白共分离等缺点，不利于下游分析^。11 , 51

密度梯度离心的目的是纯化外泌体，通常与超速离心联合使用以提高外泌体的纯度。主要有两种，一种以蔗糖为介质，在研究中应用广泛。然而，外泌体与逆转录病毒在大小和密度上极为相似，蔗糖密度梯度无法有效分离两者。Cantin等⁵²研究发现，它们在碘克沙醇梯度中的沉降速度明显不同，这使得成功从HIV-1感染细胞中分离外泌体并获得高纯度的外泌体。相比之下，密度梯度离心在外泌体纯度方面具有优势，但蔗糖溶液的高粘度会降低外泌体的沉降速度，导致时间更长^。53

聚合物沉淀

聚合物沉淀法通常以聚乙二醇（PEG）为介质，通过降低外泌体的溶解度，在离心条件下收获外泌体。该方法最初用于分离病毒。54^由于外泌体与病毒具有相似的生物物理特性，因此在科研中常采用该方法分离纯化外泌体。Rider等⁵⁵比较了超速离心、改良聚合物共沉淀法（ExtraPEG）以及市售商业试剂盒三种技术，发现前两种方法优于商业方法，且ExtraPEG更具成本效益，在纯度和回收率方面优于超速离心法。聚合物沉淀法操作相对简便，分析时间短，适合处理大剂量样品。但其纯度和回收率相对较低，可能产生假阳性，且产生的聚合物难以去除，不利于后续的功能性实验分析。

基于尺寸的分离技术

该技术主要指超滤和尺寸排阻色谱法，利用外泌体与生物样品中其他成分的尺寸差异进行分离。

尺寸排阻色谱法（SEC）的分离原理是大分子无法进入凝胶孔隙，随流动相沿多孔凝胶间的缝隙洗脱，而小分子则滞留在凝胶孔隙中，最终被流动相洗脱。目前，基于SEC原理的qEV分离柱、EVSecond纯化柱、Exo-spin外泌体纯化柱等已商品化。SEC应用快捷、简便、成本低廉，分离出的外泌体结构完整、大小均一，其生物学特性不会受到明显的不利影响，但可能掺杂有大小相近的其他颗粒，导致纯度降低^。51

超滤法通常使用不同截留分子量（MWCO）的超滤膜选择性地分离样品，其使用率约为20%，⁵⁶在外泌体研究中常起到辅助分离的作用。超滤法通常使用超滤管分离外泌体，成本低，富集效率高，且不影响外泌体的活性。然而，超滤法存在外泌体纯度低、与超滤膜存在非特异性结合等问题，导致回收率降低^。57

免疫亲和层析（IAC）

免疫亲和层析是一种基于抗体与配体特异性结合的分离纯化技术，用于从异质混合物中分离目标物质。结合效率与生物亲和对、洗脱条件和基质载体密切相关。原则上，该方法应用的生物标志物（抗原）应为外泌体膜表面的高丰度蛋白，例如四跨膜蛋白超家族、ESCRT复合物相关蛋白。当然，目标蛋白可以是外泌体表面的常见成分，也可以是促使IAC识别特定细胞来源外泌体的独特成分。与超速离心相比，IAC可以用更少的样品量获得类似的结果，并可用于外泌体的定性和定量测定。它具有特异性强、灵敏度高、纯度高、产量高的特点，并且基于磁珠的方法不设定起始样品量的上限。^{16 , 58 , 59}例如，基于微孔板的酶联免疫吸附分析技术用于富集血清、血浆和尿液等体液中的外泌体。定量检测分析发现，该方法收获的外泌体的产量与超速离心相当，但样本需求量要小得多，从400 μL血浆中提取的RNA量与2.5 mL样本超速离心获得的RNA量相同，因此比超速离心有一定优势。60^尽管如此，免疫亲和层析技术获得的外泌体的储存条件相对苛刻，不适合大规模分离外泌体，基质的非特异性干扰吸附会产生干扰蛋白，使该方法难以推广。

其他分离技术

目前市场上有多种基于上述传统分离技术的商业化试剂盒，如exoEasy Maxi试剂盒（QIAGEN公司）、MagCapture™外泌体分离试剂盒PS（Wako公司）以及Minute™高效外泌体沉淀试剂（Invent公司）。综合分析表明，商业化试剂盒具有省时、高产率、完整性好等优点。然而，由于目前商业化外泌体提取试剂盒的提取效果参差不齐，尚无一种试剂盒能够从混合样品中分离出理想的外泌体，同时试剂盒本身价格昂贵，且外泌体的产量和纯度不高。但随着外泌体分离纯化技术的不断探索、发展和创新，越来越多的新方法可供研究人员从一个或多个角度优化传统技术，具有潜在的应用价值。

最近研究开发了一种新型微涡旋芯片，该芯片集成了脂质纳米探针修饰的Morpho Menelaus蝶翅，解决了难以从生物体液中有效分离纯化细胞外囊泡的难题。当体液通过该芯片时，产生的微涡旋可以增强细胞外囊泡与蝶翅的相互作用力，同时将探针插入细胞外囊泡内部，实现高通量富集。经测试发现，该技术的分离效率超过70%，且不影响下游分析，具有潜在的应用价值^61。利用新开发的声学流体平台，将声学与微流控技术相结合，对唾液来源的外泌体进行基于大小的分离纯化。利用该技术RT-ddPCR检测外泌体中小RNA的平均产量是差速离心法的15倍，研究发现通过该技术收获外泌体有利于下游分析^62。此外，切向流过滤⁶³ 、流场流分级（FIFFF）⁶⁴和确定性横向位移阵列⁶⁵等分离技术也具有良好的富集潜力。

虽然目前已开发出多种分离纯化外泌体的方法，但这些方法均存在一些不足，无法满足所有需求。不同分离方法的组合使用可能比单一方法的分离效果更好。因此，为了提高分离效率和富集效果，从而获得理想的外泌体，许多研究团队开始联合多种方法分离纯化外泌体，以提高产量和纯度。例如，通过超速离心和超滤相结合的方法粗提取外泌体，再利用磁珠通过免疫亲和捕获技术吸附含有结肠上皮细胞特异性A33抗体的亲和体，进一步纯化外泌体。多种与结肠癌相关的外泌体蛋白已被鉴定为潜在的诊断生物标志物。66^为了弥补基于聚合物沉淀法试剂盒的不足，研究团队尝试将UC与该试剂盒相结合，从人血清中提取外泌体。实验发现，该组合方案能提供更好的产量和质量保证，适合大样本的进一步研究，满足临床应用标准。67 Koh等^68将UC与SEC相结合，不仅可以处理大体积的样本，还能有效消除污染物的干扰，取长补短，既减少了分离时间，又提高了产量，适用于从体液中富集外泌体。

特性

外泌体的表征具有特异性和同一性，因此需要几个表征指标来确定提取的成分是否为外泌体。国际细胞外囊泡学会（ISEV）提出¹⁰需要评估两类蛋白质（如与质膜和/或内体相关的跨膜或GPI锚定蛋白，EVs中回收的胞浆蛋白）来确定提取的成分是否为外泌体，并且可以通过确定与EV共分离的某些非EV结构蛋白成分的存在与否来评估来自生物体液的外泌体的纯度。在一般的研究中，我们从三个层面考虑分离外泌体的鉴定，包括TEM鉴定外泌体的形态，NTA鉴定外泌体的大小和Western Blot鉴定外泌体表面蛋白标志物。外泌体的表征方法主要分为两类：外部表征（主要是形态和粒径检测）和内含物表征（如膜蛋白，脂筏）。常用方法的目的、优缺点如表1所示。

储存稳定性

外泌体是一种很有前景的无细胞疗法，但其无法长期保存。因此，有必要研究外泌体的保存技术，以保护其生物活性，方便运输和临床应用。目前应用的保存技术主要包括冷冻、冻干和喷雾干燥。

冷冻保存

超低温保存是一种将温度降至低于生物化学反应所需温度以下以维持生物颗粒功能稳定性的储存方法，通常应用的温度为4℃、−80℃和−196℃。然而，这种储存方法容易出现“冻伤”。这里所说的“冻伤”主要与冷冻过程中渗透压失衡以及生物颗粒内部形成冰晶有关。为了克服这一缺陷，通常会选择性地添加一种或多种适当浓度的防冻剂，以延长保质期^{。77 – 79}

防冻剂通常分为渗透性和非渗透性两种。其中，渗透性防冻剂分子量较小，可以穿透细胞膜进入细胞内，阻止冰晶的形成，例如二甲基亚砜和乙二醇。研究表明，从形态学角度来看，直接冷冻会影响外泌体膜的稳定性并促进其降解，而添加DMSO的外泌体在冻存中与新鲜外泌体相似。而且，从生物活性方面来看，短期冻存（2个月内）不会显著改变外泌体的功能。70^非渗透性防冻剂可以与水形成氢键，通常是海藻糖、蔗糖和其他碳水化合物。糖通过磷脂头部与糖的OH部分相互作用，取代脂质头部周围的水分子。糖的玻璃基质可以阻止囊泡的聚集，从而减轻冰晶造成的损害。⁸⁰从安全性考虑，双糖抗冻剂是外泌体的最佳选择，其中海藻糖被列为最有效的双糖抗冻剂。81^值得注意的是，使用前应检查抗冻剂的适当浓度，以保持平衡状态，防止不必要的伤害。

冷冻干燥

冻干技术是将含有水分的物质预先冷却并冻结至冰点以下的固体状态，在真空条件下直接将冰升华并以水蒸气的形式除去，从而满足贮藏要求的技术。冻干技术主要分为三个阶段：预冻阶段、升华干燥阶段和解析干燥阶段。冻干后的外泌体冻干粉可有效降低贮藏条件。由于其在低温真空条件下完成产品的脱水干燥，可以保持其原有的活性，减少对生物组织和细胞体的损伤。该材料易于保持恒定的可贮藏状态，只需简单加水即可复溶，是保存EVs、疫苗、蛋白质等热敏性材料的合适方法。

冻干过程中，产生的冷冻脱水压力可能会破坏生物分子的结构，因此也需要选择性地添加防冻剂来保护生物材料。Charoenviriyakul等⁸²将B16BL6黑色素瘤外泌体分成三份，其中一份冻干于-80℃，一份添加海藻糖冻干，一份直接冻干，比较了外泌体的形态、蛋白质含量及其对药代动力学的影响。结果表明，添加海藻糖可有效防止冻干过程中外泌体的聚集，增加其胶体稳定性，且不改变外泌体的形态。室温冻干外泌体的蛋白质含量与-80℃冻干外泌体相近，对药代动力学的影响极小。

喷雾干燥

喷雾干燥是一种系统地应用于材料干燥的技术。外泌体溶液在干燥室中雾化后，水分与热空气接触迅速汽化，获得干燥粉末。在此过程中，雾化压力和出口温度是影响外泌体稳定性的因素。与冻干相比，喷雾干燥是一个连续过程，可实现一步粉碎，更经济，且具有可扩展性和产品粒度可调性^。79

目前综合最佳的保存方式为-80 ℃冻存。然而，不同来源、不同实验技术均影响外泌体长期保存稳定性的温度选择。研究发现，与新鲜提取的外泌体相比，-80 ℃保存4 d会改变外泌体的形貌⁸³ ， -80 ℃保存28 d会降低外泌体的生物活性^84。同时，也有研究表明，乳源性外泌体在-80 ℃保存4周后，其物理性质未发生明显变化，紫杉醇的负载率也保持稳定^35。因此，亟待从多个角度研究外泌体的保存稳定性，尤其是长期稳定性，例如从来源、药物递送途径、应用技术以及未来研究方向等方面进行探讨。总之，这有利于开展外泌体的后续功能研究，缩短实验流程，拓展其应用范围。

应用

疾病诊断

外泌体富含疾病诊断和预后的生物标志物，主要应用于肿瘤，在心血管疾病、结核病和中枢神经系统疾病等领域也取得了一些进展。与心血管疾病相关的外泌体microRNA，包括miR-499、miR-133、miR-208、miR-192、miR-194、miRNA-34a，在急性心肌梗死和心力衰竭患者中表达上调^[ 85-88 ]，为其作为诊断标志物提供了有力的依据。据报道，Dysferlinopathy（Dysferlin病）是一种由dysferlin缺乏引起的疾病。尹建军团队^[89]评估了外泌体在该疾病患者血清和尿液中的诊断能力，发现患者的外泌体中不含dysferlin，这可以作为Dysferlinopathy与正常人群相鉴别的诊断依据。外泌体中的miR-21、miR-29、miR-219、LRP6、REST1、caveolin1在中枢神经系统疾病中存在差异表达，显示出良好的临床诊断潜力^{。90 – 93}

液体活检是一种微创、方便、快速的肿瘤体外取样诊断方法。肿瘤外泌体在正常细胞致癌过程中能够促进肿瘤形成，其在体液中高度富集，可用于液体活检。由于外泌体携带的生物活性物质在健康人群和肿瘤患者中的表达情况不同，检测肿瘤外泌体中预测癌症的生物标志物有助于提高肿瘤早期诊断的特异性和敏感性。例如，外泌体蛋白CD151在肺癌患者中高表达⁹⁴ ， miR-1246和miR-21在来源于乳腺癌细胞的外泌体中高富集⁹⁵，而miR-638可作为结直肠癌的诊断标志物^96。外泌体miRNA是最常用的具有组织特异性的生物标志物。研究发现，外泌体中富含miRNA，外泌体的膜结构可以增强miRNA分子的稳定性，提升其作为疾病生物标志物的潜力。2016年，Exosome Diagnostics公司推出了全球首个癌症诊断产品——ExoDX Lung (ALK)。该产品基于外泌体检测技术，可同时检测外泌体RNA和ctDNA，对非小细胞肺癌患者进行EML4-ALK突变的实时筛查。根据Exosome Diagnostics提供的数据，ExoDx Lung (ALK)在检测非小细胞肺癌方面的灵敏度为88%，特异性为100%，可用于辅助医生判断患者是否适合接受ALK抑制剂靶向治疗，特别是对于那些无法或不愿进行组织活检的患者。

通过外泌体靶向药物输送系统治疗疾病

外泌体体积小，能有效躲避单核巨噬细胞的吞噬，并能自由穿越血管壁和细胞外基质。其表面CD55和CD59的表达避免了调理素和凝血因子的激活，使其能够在体液中广泛分布且稳定。与体外合成的脂质体等纳米递送系统相比，外泌体来源于体内，理论上具有更好的生物相容性和更低的免疫原性。事实上，由于外泌体的异质性，其表面携带各种蛋白质，这些蛋白质与细胞接触后以多种方式进入细胞。其中，受体介导的内吞作用是外泌体与靶组织之间信息沟通的主要方式之一，这优化了外泌体的内吞过程，促进了所包载药物的内化，并有利于内容物在血液中持续稳定地运输，且运输效率高。此外，外泌体具有很强的靶向组织或细胞归巢能力，能够穿透生物屏障（如血脑屏障），具有天然药物递送的优势，是一种很有前途的靶向药物载体，可用于递送基因药物、中药、西药等。97，98^但天然外泌体存在靶向性差、易在体内快速清除等问题，导致治疗效果不佳，此时通常对其进行改造，形成工程化外泌体。工程化外泌体是指负载治疗药物或经过修饰的天然外泌体，下面将主要从药物负载和表面修饰的角度阐述外泌体靶向递送系统的应用。

药物加载类型

西药是利用外泌体作为药物载体递送的治疗药物之一，可在癌症、炎症等多种病理过程中发挥作用。癌症的死亡率长期以来居高不下，开发高效的癌症治疗策略是国内外科研团队努力的目标。阿霉素是一种两亲性药物，能够抑制血管生成、控制肿瘤生长而发挥治疗作用，属于广谱抗肿瘤药物。Yang等⁹⁹利用斑马鱼模型，研究了脑内皮来源的外泌体通过血脑屏障递送抗肿瘤药物阿霉素的功效。图片显示，外泌体成功地将药物装载穿过血脑屏障，可显著抑制肿瘤的生长，证实了外泌体可以作为载体发挥作用。此外，卟啉、 ¹⁰⁰替拉扎明、^101多西他赛、顺铂等抗癌药物也可以通过外泌体发挥作用。

过氧化氢酶（CAT）是最有效的抗氧化剂之一，能抑制炎症，保护多巴胺能神经元，用于治疗神经退行性疾病。神经退行性疾病是由于神经元和/或其髓鞘的丢失引起的，一般根据临床症状进行诊断。血脑屏障（BBB）的存在限制了近98%的中枢神经系统疾病治疗药物的应用，临床应用极其困难。102慢性^疾病需要长期药物治疗^。103，104。Haney等人在研究CAT对帕金森病的治疗作用时。105^发现用外泌体包裹CAT可以有效降低氧化应激，提高帕金森病体内外模型中神经元的存活率。同时，将CAT负载于外泌体上，可以保持其生物活性，降低免疫原性，延长血液循环时间，解决其易失活、降解快的不足，从而增强治疗效果。综上所述，Exo-CAT制剂有望成为治疗神经退行性疾病的通用策略。

传统中药，包括单体活性成分和复方制剂，因其毒性和副作用较小，在外泌体递送系统研究中得到广泛应用。

紫杉醇(PTX)虽然是广泛使用的抗肿瘤药物，可在多种恶性肿瘤中发挥治疗作用^35，但其为强疏水性化合物，且具有剂量依赖性的毒副作用，因此其临床应用受到限制^{106，107 。近年来，利用外泌体递送PTX弥补这一缺陷的研究已被广泛报道。例如，} Wang等^{108选用经典的活化M1型巨噬细胞来源的外泌体}作为载体，降低了PTX的毒性，提高了其生物利用度。PTX不仅被成功递送至小鼠的肿瘤组织，而且通过激活NF-κB通路建立促炎环境，增强PTX的治疗效果。

姜黄素是一种亲脂性多酚化合物，其溶解度低、稳定性差、代谢快、半衰期短等缺陷导致生物利用度较低，限制了其在疾病治疗中的应用。Sun等¹⁰⁹将姜黄素负载到外泌体上形成复合物，通过提高姜黄素的溶解度、稳定性和生物利用度来增强其抗炎活性。用该复合物治疗的小鼠能够抵抗脂多糖（LPS）诱导的脓毒症休克。此外，姜黄素还具有抗肿瘤、抗氧化、抗动脉粥样硬化等作用。

负载浆果花青素的外泌体对卵巢癌细胞增殖有良好的抑制活性^110。负载梓醇的外泌体可以起到神经保护作用^{111。负载β-榄}香烯的外泌体可以抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，对癌细胞的耐药性也有一定的改善作用^112，113此外，外泌体还可以负载雷公藤内酯醇¹¹⁴或中药复方补阳还五汤^115 ，以弥补单一给药的不足，增强治疗效果。

外泌体还可以递送DNA和RNA等基因治疗剂，并应用于基因治疗策略。例如，寡核苷酸可以沉默特定基因，从而治疗多种人类疾病，包括癌症或神经退行性疾病。寡核苷酸制剂（ONT）是一种通过靶向RNA或DNA来阻止引起疾病表型的蛋白质表达的新型药物，例如，将装载有疏水性siRNA（hsiRNA）的外泌体递送至大脑，靶向亨廷顿蛋白mRNA，是治疗亨廷顿舞蹈症和其他神经退行性疾病的有效方法^116。同样，外泌体可以携带治疗性RNA至靶细胞，例如将外源性siRNA靶向人体血液细胞中的单核细胞和淋巴细胞，可选择性地沉默MAPK1基因^。117

给药途径

外泌体递送系统给药途径多样，常见的途径有静脉注射^{118、119、皮下注射120、腹腔注射121、122、瘤内注射123、鼻腔给药32、105、124、125和口服35。从本质}上讲^，药物给药^途径与各种^疾病的治疗^效果密切^{相关，不同的药物给药途径也影响药物在}体内的生物分布和快速清除率。因此，有必要研究外泌体药物递送系统给药途径的影响。

药物装载方式

根据治疗药物是否直接负载于外泌体，主要分为两大类药物负载类型：前分泌药物负载和后分泌药物负载。前分泌药物负载是指治疗药物来源于或负载于亲本细胞分泌出的工程化外泌体，此类操作简单，但药物负载效率无法控制，且可能损伤膜蛋白的天然生理功能。顾名思义，后分泌药物负载是指将治疗药物以一定的方式直接添加于外泌体，但可能存在外泌体聚集、膜损伤及产量低等问题^{101,126,127 。电穿孔和超声波处理是目前最常用的药物负载方法，}相对方便、高效，外泌体的药物负载率可能与药物的疏水性、药物负载方式、外泌体的脂质组成等有关¹⁰⁰。因此在实际研究中主要根据药物的物理或化学特性选择合适的载药方法，常用方法如图2所示。

共培养方式有两种，一是将治疗药物与亲本细胞共培养，使治疗药物分散或通过亲本细胞的内吞作用将胞质中的部分治疗药物装载到分泌的外泌体中。二是将外泌体与治疗药物直接共培养，在适当的条件下混合。其装载效率主要取决于溶液中药物的浓度梯度及其疏水性，高浓度的疏水性药物通常具有较高的装载效率。105^该方法操作简便，重现性高，不影响外泌体膜结构的完整性，但装载效率低，需要大量的治疗药物，同时还需考察治疗药物是否对亲本细胞有毒副作用以及是否通过改变外泌体的表面电荷而影响稳定性。

电穿孔是将外泌体和治疗药物的悬浮液暴露于电场中，在短暂的高压脉冲作用下，外泌体膜会产生暂时性的孔隙，从而使治疗药物渗透到外泌体中。电穿孔是一种比较成熟的方法，简单、省时，可以用来将核苷酸、阿霉素等药物负载到外泌体中^130。外泌体的浓度会影响电穿孔的效率。Wahlgren等¹¹⁷利用外周血外泌体作为载体，通过电穿孔技术递送治疗性siRNA。实验中考察了外泌体浓度、siRNA浓度及电穿孔参数对电穿孔效率的影响，发现siRNA和电容的变化不会影响电穿孔效率，且当外泌体浓度在0.25～1 mg/mL范围内时，电穿孔效率最高。但该方法也存在破坏膜结构完整性、降低装载效率、装载率低等缺点。使用高压脉冲会导致外泌体聚集。同时，该方法可能会破坏蛋白质结构并影响其活性，限制了其应用。

超声处理具有高效的载药效率，能持续释放药物，尤其是疏水性药物，且能避免蛋白酶的破坏。但该方法容易导致外泌体聚集，影响其免疫活性，不仅对仪器要求高，而且可能破坏外泌体的质膜结构，造成药物渗漏，导致载药效果不理想。超声处理可以改变膜的高刚性，外泌体膜的重组可获得较高的载药效率和持续的药物释放。Kim等32比较了共培养、电穿孔和超声处理3种载药方式的载药率，结果发现经超声处理的外泌体的载药量最高，证实了上述假设。同样，Salarpour等³³对超声处理的外泌体进行了研究。¹³¹研究了 37°C 共培养和超声处理对 PTX (疏水性药物) 包封率的影响，发现超声处理的载药量 (9.21±0.41 ng/μg) 高于共培养的载药量 (7.40±0.37 ng/μg)，与 Kim 的结果相似。

挤出法通常利用挤出机实现外泌体的载药。在挤出过程中，外泌体膜被破坏并与治疗药物剧烈混合。132^挤出法可以获得更高的载药量。例如，与共培养和冻融循环相比，通过挤出方法负载过氧化氢酶（CAT）的外泌体具有最高的包封率并表现出强的催化活性。因此，此类外泌体提供了最有效的神经保护作用，这是由于挤出重塑了外泌体膜，使CAT能够通过相对紧密且高度结构化的脂质双层扩散，从而获得了较高的包封率。105^但是，它可能破坏外泌体的质膜结构并导致药物泄漏。是否会产生细胞毒性还有待研究。

冻融循环是一种物理和化学过程，只需将外泌体与药物混合，在−80°C或液氮中冷冻，然后在室温下解冻即可。132,133^{冻融循环的载药量通常低于超声处理和挤压。外泌体可能聚集并导致其}体积增大。此外，蛋白质也容易降解并影响生物活性。

在皂苷辅助治疗过程中，皂苷是有效的细胞质膜通透剂。它选择性地与外泌体膜上的胆固醇形成复合物，在膜表面形成多孔结构，从而促进治疗药物的掺入。研究发现，负载ProBA [meso-四(4-羧苯基)卟啉]的皂苷处理后的外泌体具有较高的载药率，药物摄入量约为8%，显著高于游离药物（2%），因此可以证明皂苷辅助治疗在不影响药物递送能力的情况下增强了外泌体中卟啉的负载量。100^{然而，皂苷是一类在体内具有溶血性的表面活性剂，因此}需要限制皂苷的浓度，并且在共孵育后应立即洗涤和纯化外泌体^。132,134

综上所述，无论是分泌前装载还是分泌后装载，上述方法都无法同时装载不同性质的治疗药物组合。Lee等¹⁰¹将脂质体应用于细胞外囊泡的表面修饰，MFL（膜融合脂质体）可以有效地将亲脂性药物（紫杉醇）和亲水性药物（替拉扎明）同时共装载到细胞外囊泡中，且不影响膜蛋白原有的功能性表达，因此可以认为是一种通用的策略。总之，实际应用中无论采用哪种方法，都应综合考虑药物性质、药物装载量、效率、对外泌体膜的损伤以及对后续实验的影响等因素，找到最佳方法。

表面改性

表面修饰是将外泌体表面蛋白作为锚定装置或亲和标签，通过一定手段将符合要求的蛋白质或多肽组分修饰到颗粒表面的过程。天然外泌体由于稳定性差、消除快等不足而无法有效递送药物或进行靶向应用，需要进行表面修饰。29外泌^体最大的优势之一是内源性，可以避免引起免疫反应等不良反应。然而，外泌体的递送效率受亲本细胞和受体细胞的影响，不同来源外泌体的产量差异显著，天然外泌体存在靶向性差的问题。为了满足实验需要，通过表面修饰制备工程化外泌体是一种有实际应用价值的方法。利用靶向配体对外泌体进行表面功能化，可以帮助其选择性地递送至靶细胞，并使外泌体在产量和靶向治疗方面达到标准，从而实现外泌体的精准治疗，加速外泌体的临床应用。

为了将治疗药物精准靶向至病灶部位，近年来常用的方法包括化学连接靶向肽、利用基因工程修饰外泌体膜或祖细胞、磁性纳米粒子技术、静电相互作用以及后插入等。部分表面修饰外泌体的应用见表2。

 

基于目前流行的表面修饰方法的局限性，尹教授团队筛选出噬菌体CP05偶联靶向分子（M12、RVG、SP94）形成嵌合肽，然后将其与外泌体表面的CD63结合，可以捕获不同来源的外泌体。该方法修饰效率高，不仅捕获的外泌体量大，而且可以增强靶向性，使修饰后的外泌体分别在肌肉、脑和皮下肿瘤中富集。CP05修饰的外泌体生理特性没有发生明显改变，没有改变外泌体的结构和表面分子，有望用于临床癌症的快速检测和治疗药物的有效载体^。139此外，Tamura等[14]报道了一种新型的CP05修饰外泌体，该修饰的外泌体可以作为肿瘤的靶向载体，用于肿瘤的治疗。 ¹⁴⁰利用阳离子化的支链淀粉修饰外泌体，使其能够靶向肝细胞的去唾液酸糖蛋白受体，有助于实现外泌体的精准治疗，增强治疗效果。Lee等¹⁰¹还优化了化学连接和靶向肽的方法，用叠氮化物-MFL处理母细胞，生成叠氮化物-EVs，再通过生物正交反应将其与肿瘤靶向肽偶联物DBCO-CGKPK连接。在这个过程中，DBCO-CGKPK采用无铜催化点击化学进行连接。此类工程化的EVs可用于内部装载治疗药物，外部可修饰成多种功能。外源掺入MFL进行表面修饰不会影响在EVs生物学功能中起决定性作用的膜蛋白。

工程化外泌体在药物递送应用上并不具备绝对优势。有研究发现，采用相同的装载方法装载胆固醇修饰的siRNA，分别制备工程化外泌体和阴离子融合脂质体，比较其递送能力。工程化外泌体无法功能性地递送相关的小RNA，而阴离子融合脂质体可以诱导siRNA介导的靶基因敲除。141^因此，在考虑是否应用工程化外泌体时，需要结合实际情况，深入了解其分子转移机制及特异性，切忌盲目应用。

结论

与脂质体、纳米粒、微球、微乳等合成载药系统相比，外泌体的内源性具有天然而独特的优势。外泌体的优越性使其成为细胞间通讯的重要媒介，在调节正常生命活动、疾病诊断和治疗中发挥着独特的生物学功能。外泌体作为当前的研究热点，受到了国内外研究者的广泛关注。然而，以外泌体内容物为标志物用于疾病诊断和预后的检测技术尚不完善，外泌体能否尽快应用于临床，很大程度上取决于对现有外泌体问题的优化和改进。如何提高外泌体的产量和纯度是重中之重，这也一直是限制其转化应用的瓶颈。近年来的研究表明，适当组合几种方法提取纯化外泌体可有效改善上述问题，而如何组合才能达到最佳效果还有待进一步研究。其次，外泌体的分泌机制和融合机制尚不明确，外泌体异质性对药物载药效率的影响有待进一步揭示，外泌体的载药能力及增强靶向性的方法也需要优化和改进。开展全方位、多领域的研究，解析其生物学功能，为后续的药代动力学、毒理学研究及临床试验奠定基础，有助于更好地了解机体状态，从而诊断和治疗疾病。