揭秘 | MSC外泌体真的是慢性炎症克星吗？
炎症与慢性疾病的关系
炎症是机体对感染和组织损伤的重要保护性反应，但异常的炎症反应却与多种慢性疾病的发生发展密切相关，如心力衰竭、骨关节炎、类风湿关节炎、炎症性肠病、糖尿病、急性肺损伤、急性肾损伤以及组织纤维化等。此外，炎症还与疲劳和疼痛有着紧密的联系。因此，探索有效的抗炎治疗方法对于多种慢性疾病的治疗具有重要意义。
间充质干细胞（MSCs）的潜力
MSCs是一类具有免疫调节和抗炎特性的成体间充质细胞，其通过分泌抗炎细胞因子（如IL-10、TGF-β、IL-1RA）和调节免疫细胞活性来发挥治疗作用。在多种炎症相关疾病的治疗中，MSCs展现出了良好的应用前景。而MSCs的培养上清液（MSC-CM）作为一种细胞因子和外泌体等分泌因子的混合物，因其避免了细胞移植可能带来的免疫排斥和致瘤风险，成为了MSCs治疗的一种有潜力的替代方案。
近期由日本科学家团队发表在PLOS One杂志上的一篇 “人骨髓间充质干细胞培养上清液多次全身给药用于多种慢性疾病的安评” 文章阐述多次全身给药MSC-CM在治疗多种慢性疾病时是安全的，并且可能具有抗炎效果。
研究中未观察到严重的不良事件，且在炎症状态较为明显的患者中，MSC-CM给药后CRP水平显著降低，表明其可能对炎症有调节作用。然而，对于CRP水平正常的患者，MSC-CM给药并未引发炎症反应。这些发现表明，MSC-CM作为一种新型治疗慢性疾病的手段具有潜力，但需要进一步的研究来充分探索其治疗效果和作用机制。
01
为什么研究MSC-CM在慢性炎症中的作用
研究的必要性
尽管已有部分关于MSC-CM在局部给药治疗中的临床应用报道，但关于其全身给药的安全性研究还相对较少，尤其是对于较大剂量、多次给药的情况。因此，本研究针对多种慢性疾病患者，评估了多次全身给药MSC-CM的安全性，这对于推动MSC-CM在临床治疗中的应用具有重要的参考价值。
研究方法
伦理审查与参与者招募：研究遵循了医学和健康研究涉及人类受试者的伦理准则，获得了机构伦理审查委员会的批准，并在临床试验注册机构进行了登记。研究对象为2022年10月至2023年8月间在日本西滨诊所招募的55名患有不同慢性疾病的患者，这些患者均对标准治疗效果不满意或因担心副作用等原因拒绝接受标准治疗，且医生认为其适合接受MSC-CM治疗。
MSC-CM的制备
采用无动物源（AOF）培养基培养人脂肪来源MSCs（AD-MSCs）和人脐带来源MSCs（UC-MSCs），并收集其培养上清液作为MSC-CM。在制备过程中，对MSC-CM进行了病毒检测、内毒素检测、无菌检测、支原体检测以及外观检查等多项质量控制检测，确保其安全性。此外，还通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定了MSC-CM中肝细胞生长因子（HGF）和外泌体的含量，以评估其治疗潜力。
体外实验验证
利用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）模型，研究了MSC-CM的抗炎效果。通过检测TNF-α诱导的HUVECs中IL-6和IL-8的mRNA表达水平，发现AD-MSC-CM和UC-MSC-CM均能抑制炎症反应，这为MSC-CM在体内可能发挥抗炎作用提供了体外实验依据。
给药方案
根据患者的具体疾病类型和目标器官，采用了不同的给药途径，包括肺动脉内给药、降主动脉内给药、静脉内给药以及吸入给药。其中，肺动脉和降主动脉内给药主要用于心力衰竭和肺部疾病患者，以将MSC-CM直接输送到病变部位；静脉内给药则用于全身性疲劳患者；吸入给药仅在静脉给药困难时作为替代方案。给药频率和次数根据不同的给药途径有所不同，如肺动脉和降主动脉内给药每月进行3次，静脉内给药每月3次，吸入给药每周1次，共12次。
安全性和疗效监测
在给药前和给药后，通过症状评估和血液检查来监测不良事件的发生情况，并测量血清C反应蛋白（CRP）水平以评估炎症反应的变化。CRP是一种在炎症发生时迅速分泌的急性期蛋白，其水平的变化可以作为评估MSC-CM给药是否引发炎症反应的重要指标。
02
研究信息
外泌体来源
人脂肪来源间充质细胞（AD-MSCs）
人脐带来源间充质细胞（UC-MSCs）
外泌体分离方法
MSC-CM（含外泌体）通过收集细胞培养上清液，经过0.22μm滤膜过滤后获得
外泌体质量控制
病毒检测：在MSC-CM的制备过程中进行了病毒检测。
内毒素检测：对最终产品进行了内毒素检测。
无菌检测：进行了无菌检测以确保无污染。
支原体检测：进行了支原体检测。
外观检查：对MSC-CM进行了外观检查，确认无异物污染。
给药方式
肺动脉内给药（PA）、降主动脉内给药（DAo）、静脉内给药（IV）、吸入给药（INH）
给药剂量
肺动脉和降主动脉内给药：30mL MSC-CM与500mL生理盐水混合，给药时间为约24小时。
静脉内给药：10mL MSC-CM与500mL生理盐水混合，给药时间为约3小时。
吸入给药：1mL MSC-CM与4mL生理盐水混合，使用雾化器给药，每周1次，共12次。
治疗对象
55名患有不同慢性疾病的患者，包括心力衰竭、全身疲劳、肺部疾病和慢性肾衰竭患者。
疾病类型
心力衰竭、全身疲劳、肺部疾病（如弥漫性泛细支气管炎、间质性肺病、慢性阻塞性肺病等）慢性肾衰竭
关键治疗分子
肝细胞生长因子（HGF）：通过ELISA检测其在MSC-CM中的浓度。
外泌体：通过CD63/CD63 ELISA试剂盒检测其在MSC-CM中的含量。
治疗机制
抗炎作用：MSC-CM通过抑制TNF-α诱导的IL-6和IL-8 mRNA表达，显示出抗炎效果。
免疫调节：MSCs分泌的抗炎细胞因子（如IL-10、TGF-β、IL-1RA）和调节免疫细胞活性，有助于恢复炎症状态下的免疫平衡。
组织修复：MSC-CM中的生长因子（如HGF）和外泌体可能促进受损组织的修复和再生。
03
研究结果
MSC-CM的特征分析
ELISA检测结果显示，AD-MSC-CM和UC-MSC-CM中HGF和外泌体的含量没有显著差异，这表明两种来源的MSC-CM在成分上具有一定的相似性，可能具有相似的治疗潜力。
HGF与外泌体在MSC-CM中的水平。（A）检测了AD-MSC-CM与UC-MSC-CM中的HGF浓度。（B）评估了AD-MSC-CM与UC-MSC-CM中的外泌体数量。外泌体水平以相对值表示。
安全性评估
在174次给药过程中，未观察到任何严重的不良事件，如死亡、危及生命的状况、显著的残疾或永久性损伤以及需要紧急医疗干预的情况。仅有4名患者出现了轻微的不良反应，如头晕、厌食、肠炎、肾后性肾积水和发热等，但这些不良反应的因果关系与MSC-CM并不明确，且均在1 - 2天内自行缓解，无需医疗干预。此外，对于出现肾后性肾积水的患者，其在给药后36天才进行了血样采集，因此无法确定该不良事件是否与MSC-CM给药有关。
从整体上看，给药后所有患者的平均CRP水平略有下降，但差异未达到统计学显著性（p = 0.5994）。然而，当根据给药途径分别分析时，虽然各组CRP水平均有下降趋势，但同样未达到统计学显著性。特别值得注意的是，吸入给药组的CRP水平似乎降低得更为明显，但由于该组仅有一名患者，因此无法得出确切结论。此外，研究还根据患者给药前的CRP水平（高于0.3mg/dL和低于0.3mg/dL）进行了分组分析。结果显示，在CRP水平高于0.3mg/dL的患者中，MSC-CM给药后CRP水平显著降低（p = 0.0122），这表明MSC-CM给药可能对处于炎症状态的患者具有抗炎作用；而在CRP水平低于0.3mg/dL的患者中，CRP水平虽有显著升高（p = 0.0415），但给药后的CRP水平仍低于0.3mg/dL，且根据Nehring等人的标准，该水平的升高并不具有临床意义，因此可以认为MSC-CM给药并未在正常炎症状态的患者中引发炎症反应。
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中促炎细胞因子IL-6与IL-8的表达。经MSC-CM处理后，炎症诱导的HUVECs中IL-6 mRNA（A）和CXCL8/IL-8 mRNA（B）的表达情况。实验组分别采用对照培养基（control）、AD-MSC-CM或75% UC-MSC-CM处理HUVECs，部分组别添加10ng/mL TNF-α，处理时长为3天。
MSC-CM给药前后CRP水平的变化。测定全部55例患者（A）、23例肺动脉给药（PA）患者（B）、10例降主动脉给药（DAo）患者（C）、21例静脉给药（IV）患者（D）和1例吸入给药（INH）患者（E）血清中CRP水平（mg/dL）在MSC-CM给药前后的变化。数据以均值±标准差表示。采用双尾Wilcoxon配对符号秩检验进行统计分析。注：PA（肺动脉给药）；DAo（降主动脉给药）；IV（静脉给药）；INH（吸入给药）。
MSC-CM给药前后CRP水平变化。(A) 给药前CRP水平低于0.3 mg/dL的组别；(B) 给药前CRP水平高于0.3 mg/dL的组别。研究检测了55例受试者血清中CRP水平（mg/dL）在MSC-CM给药前后的变化。
总结
本研究通过在55名患有多种慢性疾病的患者中进行多次全身给药MSC-CM的安全性评估，结果表明MSC-CM给药是安全的，未引发严重的不良事件。
此外，MSC-CM给药还可能具有抗炎作用，尤其是在那些炎症状态较为明显的患者中，其CRP水平在给药后显著降低。
这些发现为MSC-CM作为一种新型治疗慢性疾病的手段提供了有力的支持，但同时也指出了未来研究需要进一步探索的方向，例如扩大样本量以更准确地评估不同给药途径的疗效差异，以及综合评估MSC-CM给药对患者其他生理指标（如抗氧化能力、Galectin-3、NT-proBNP水平以及肾功能等）的影响，从而更全面地了解MSC-CM的治疗潜力和作用机制。
MSC-CM中含有丰富的外泌体，这些外泌体携带了多种生物活性分子，如蛋白质、mRNA、miRNA等，能够与靶细胞相互作用并调节其功能。本研究中MSC-CM的抗炎效果可能部分归因于外泌体。
炎症是机体对感染和组织损伤的重要保护性反应，但异常的炎症反应却与多种慢性疾病的发生发展密切相关，如心力衰竭、骨关节炎、类风湿关节炎、炎症性肠病、糖尿病、急性肺损伤、急性肾损伤以及组织纤维化等。此外，炎症还与疲劳和疼痛有着紧密的联系。因此，探索有效的抗炎治疗方法对于多种慢性疾病的治疗具有重要意义。
间充质干细胞（MSCs）的潜力
MSCs是一类具有免疫调节和抗炎特性的成体间充质细胞，其通过分泌抗炎细胞因子（如IL-10、TGF-β、IL-1RA）和调节免疫细胞活性来发挥治疗作用。在多种炎症相关疾病的治疗中，MSCs展现出了良好的应用前景。而MSCs的培养上清液（MSC-CM）作为一种细胞因子和外泌体等分泌因子的混合物，因其避免了细胞移植可能带来的免疫排斥和致瘤风险，成为了MSCs治疗的一种有潜力的替代方案。
近期由日本科学家团队发表在PLOS One杂志上的一篇 “人骨髓间充质干细胞培养上清液多次全身给药用于多种慢性疾病的安评” 文章阐述多次全身给药MSC-CM在治疗多种慢性疾病时是安全的，并且可能具有抗炎效果。
研究中未观察到严重的不良事件，且在炎症状态较为明显的患者中，MSC-CM给药后CRP水平显著降低，表明其可能对炎症有调节作用。然而，对于CRP水平正常的患者，MSC-CM给药并未引发炎症反应。这些发现表明，MSC-CM作为一种新型治疗慢性疾病的手段具有潜力，但需要进一步的研究来充分探索其治疗效果和作用机制。
为什么研究MSC-CM在慢性炎症中的作用
尽管已有部分关于MSC-CM在局部给药治疗中的临床应用报道，但关于其全身给药的安全性研究还相对较少，尤其是对于较大剂量、多次给药的情况。因此，本研究针对多种慢性疾病患者，评估了多次全身给药MSC-CM的安全性，这对于推动MSC-CM在临床治疗中的应用具有重要的参考价值。
研究信息
人脐带来源间充质细胞（UC-MSCs）
外泌体分离方法
MSC-CM（含外泌体）通过收集细胞培养上清液，经过0.22μm滤膜过滤后获得
外泌体质量控制
病毒检测：在MSC-CM的制备过程中进行了病毒检测。
内毒素检测：对最终产品进行了内毒素检测。
无菌检测：进行了无菌检测以确保无污染。
支原体检测：进行了支原体检测。
外观检查：对MSC-CM进行了外观检查，确认无异物污染。
给药方式
肺动脉内给药（PA）、降主动脉内给药（DAo）、静脉内给药（IV）、吸入给药（INH）
给药剂量
肺动脉和降主动脉内给药：30mL MSC-CM与500mL生理盐水混合，给药时间为约24小时。
静脉内给药：10mL MSC-CM与500mL生理盐水混合，给药时间为约3小时。
吸入给药：1mL MSC-CM与4mL生理盐水混合，使用雾化器给药，每周1次，共12次。
治疗对象
55名患有不同慢性疾病的患者，包括心力衰竭、全身疲劳、肺部疾病和慢性肾衰竭患者。
疾病类型
心力衰竭、全身疲劳、肺部疾病（如弥漫性泛细支气管炎、间质性肺病、慢性阻塞性肺病等）慢性肾衰竭
关键治疗分子
肝细胞生长因子（HGF）：通过ELISA检测其在MSC-CM中的浓度。
外泌体：通过CD63/CD63 ELISA试剂盒检测其在MSC-CM中的含量。
治疗机制
抗炎作用：MSC-CM通过抑制TNF-α诱导的IL-6和IL-8 mRNA表达，显示出抗炎效果。
免疫调节：MSCs分泌的抗炎细胞因子（如IL-10、TGF-β、IL-1RA）和调节免疫细胞活性，有助于恢复炎症状态下的免疫平衡。
组织修复：MSC-CM中的生长因子（如HGF）和外泌体可能促进受损组织的修复和再生。
在174次给药过程中，未观察到任何严重的不良事件，如死亡、危及生命的状况、显著的残疾或永久性损伤以及需要紧急医疗干预的情况。仅有4名患者出现了轻微的不良反应，如头晕、厌食、肠炎、肾后性肾积水和发热等，但这些不良反应的因果关系与MSC-CM并不明确，且均在1 - 2天内自行缓解，无需医疗干预。此外，对于出现肾后性肾积水的患者，其在给药后36天才进行了血样采集，因此无法确定该不良事件是否与MSC-CM给药有关。
从整体上看，给药后所有患者的平均CRP水平略有下降，但差异未达到统计学显著性（p = 0.5994）。然而，当根据给药途径分别分析时，虽然各组CRP水平均有下降趋势，但同样未达到统计学显著性。特别值得注意的是，吸入给药组的CRP水平似乎降低得更为明显，但由于该组仅有一名患者，因此无法得出确切结论。此外，研究还根据患者给药前的CRP水平（高于0.3mg/dL和低于0.3mg/dL）进行了分组分析。结果显示，在CRP水平高于0.3mg/dL的患者中，MSC-CM给药后CRP水平显著降低（p = 0.0122），这表明MSC-CM给药可能对处于炎症状态的患者具有抗炎作用；而在CRP水平低于0.3mg/dL的患者中，CRP水平虽有显著升高（p = 0.0415），但给药后的CRP水平仍低于0.3mg/dL，且根据Nehring等人的标准，该水平的升高并不具有临床意义，因此可以认为MSC-CM给药并未在正常炎症状态的患者中引发炎症反应。
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中促炎细胞因子IL-6与IL-8的表达。经MSC-CM处理后，炎症诱导的HUVECs中IL-6 mRNA（A）和CXCL8/IL-8 mRNA（B）的表达情况。实验组分别采用对照培养基（control）、AD-MSC-CM或75% UC-MSC-CM处理HUVECs，部分组别添加10ng/mL TNF-α，处理时长为3天。
MSC-CM给药前后CRP水平的变化。测定全部55例患者（A）、23例肺动脉给药（PA）患者（B）、10例降主动脉给药（DAo）患者（C）、21例静脉给药（IV）患者（D）和1例吸入给药（INH）患者（E）血清中CRP水平（mg/dL）在MSC-CM给药前后的变化。数据以均值±标准差表示。采用双尾Wilcoxon配对符号秩检验进行统计分析。注：PA（肺动脉给药）；DAo（降主动脉给药）；IV（静脉给药）；INH（吸入给药）。
MSC-CM给药前后CRP水平变化。(A) 给药前CRP水平低于0.3 mg/dL的组别；(B) 给药前CRP水平高于0.3 mg/dL的组别。研究检测了55例受试者血清中CRP水平（mg/dL）在MSC-CM给药前后的变化。
