外泌体应用于创面修复的研究进展
【摘要】
外泌体是一种细胞分泌的双层膜结构囊泡，是细胞旁分泌活动的一种重要方式，具有来源广泛、安全性高等特点。该文对近年外泌体促进创面修复的研究进展进行了综述，外泌体可通过调节免疫、调控成纤维细胞活动、促进血管生成、抑制瘢痕形成等机制应用于创面的治疗，和传统的干细胞治疗相比，有着更为良好的临床应用前景。
【关键词】外泌体；创面愈合；组织修复
基金项目：北京大学医学科技创新平台发展基金——医学交叉种子基金资助项目（BMU2018MX001）
Reserch advances in the application of exosome in wound healing
Zhang Chen, Bi Hongsen, Zhao Zhenmin, Nie Fangfei
Department of Plastic Surgery, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China
Corresponding author: Bi Hongsen, Email: 313503068@qq.com
【Summary】
Exosome is a double-layer membrane vesicle secreted by several kinds of cells. Exosome is major way of cell paracrine activity with a wide range of sources and high security feature. This paper reviews recent progress of exosomes in promoting wound healing. Studies have shown that exosomes can be applied to wound treatment by immune regulation, regulating fibroblast activity, promoting angiogenesis, inhibiting scar formation and other mechanisms. Compared with traditional stem cell therapy, exosomes have better applied prospect in clinical practise.
【Key words】Exosome;Wound healing;Tissue repairing
Fund program: Interdisciplinary Medicine Seed Fund of Peking University(BMU2018MX001)
Disclosure of Conflicts of Interest: The authors have no financial interest to declare in relation to the content of this article.
慢性创面的治疗是目前迫切需要解决的重大医疗难题。传统手术等治疗手段虽能在一定程度上带来改善，但是极难彻底治愈。再生医学是使用生物学和工程学理论制造被损伤、功能受损或丢失的组织或器官，被认为是创面治疗的未来发展方向［1］。目前，再生医学的研究关注于利用干细胞发挥治疗作用［2］，然而直接利用干细胞分化构建组织或器官进行治疗存在很大的潜在风险［3］。干细胞外分泌的外泌体可携带供体干细胞的遗传信息并导入到受体细胞中，既能发挥治疗作用，也避免了干细胞治疗的弊端。因此，如何应用外泌体治疗创面有着重大临床与科研意义。目前已有相当多的研究者报道了外泌体应用于各种组织修复中的进展，如心肌损伤［4］、肝脏损伤［5］、神经系统损伤［6］、骨与软骨损伤［7］等。本文就外泌体应用于整形外科临床上经常需要解决的皮肤软组织创面修复的相关研究及治疗机制做如下综述。
一、外泌体的特性和功能
外泌体是一种双层膜样结构囊泡，直径范围为50～150 nm［8］， 通常在电子投射显微镜下呈茶托形。1987年，Johnstone等 ［9］首次于羊网织红细胞中发现，并将之命名为“exosome”，当时外泌体被认为是携带细胞废弃蛋白产物的膜性微囊泡。目前，已发现多种细胞均可分泌外泌体，包括T细胞、B细胞、树突状细胞、施万细胞、血小板、内皮细胞、肿瘤细胞、心肌细胞和间充质干细胞等［10］。此外，在多种体液中也发现含有外泌体成分，如血液、尿液、唾液、胆汁、脑脊液、母乳、附睾液、精液、腹水、羊水和痰等［11］。
不同组织和细胞来源的外泌体其组分并不相同，已有报道表明外泌体成分包括4 563种蛋白质，764种miRNAs，1 639 种mRNA和194种脂质成分等［12］，此外，同一细胞来源的外泌体也可表现出多态性［13］。外泌体包含的mRNA、miRNA及多种其他非编码RNA，在细胞间通讯、表面修饰等功能中发挥重要作用［14］。其中的一些特异性miRNA如 Let-7、microRNA-1、microRNA-16、microRNA-21、microRNA-151，microRNA-181等与造血、血管生成、胞外分泌和肿瘤病生理等功能密切相关［15-17］。外泌体也含有多种蛋白质，如热休克蛋白HSP90［18］和HSP70［19］，四跨膜蛋白超家族CD9、CD63、CD81和CD82等［20］，主要调节受体细胞的迁移、黏附和融合。此外还有一些可反映外泌体分泌细胞来源的胞内蛋白成分。由于外泌体囊泡膜的保护，这些RNA和蛋白质可免于在胞外环境中被降解，从而可被受体细胞摄取，并以此调节受体细胞的基因表达和蛋白质合成，此外也可作为标记物来鉴定获得的外泌体。脂质（磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、磷脂酰肌醇等）是外泌体膜的必要组成成分，不同来源的外泌体其脂质构成成分和比例各不相同，因此脂质在外泌体鉴别上有着重要意义，此外其对于外泌体的合成与分泌同样有着重要研究价值［21］。
二、外泌体在皮肤软组织创面修复中的作用 皮肤是人体最大的器官，成人皮肤平均占体重的16%。皮肤具有屏障、感觉、调节体温、吸收及分泌排泄等作用，参与全身的功能活动，以维持机体和外界环境的对立统一及人体的健康［22］。皮肤创面愈合分为炎症期、增生期和重建期。当创面愈合过程受到诸如感染、缺血、局部或系统性疾病等各种因素的干扰时，伤口可能延迟愈合或不愈合，既而形成慢性创面［23］，给患者、家庭及社会均带来极大的负担［24］。
近年来，外泌体的相关研究为皮肤创面修复提供了新的治疗方法和研究方向。既往研究表明，在创面愈合的各个阶段外泌体均可通过不同的机制，包括调节炎症反应、调节成纤维细胞功能、促进血管生成及抑制瘢痕形成等，发挥作用促进创面愈合［25］。
（一）调节炎症反应
炎症是身体对有害刺激作出反应的自我防御机制，但慢性和过度的炎症反应则会导致伤口愈合延迟，包括纤维化、过度瘢痕形成或再上皮化抑制［26］。因此，调节炎症反应对于创面的愈合至关重要。
Ti 等［27］报道用脂多糖预处理的人脐带间充质细胞释放的外泌体，被巨噬细胞摄取后，可通过转运miR-let7b调控TLR4、NF-κB、STAT3、AKT调节信号通路来调节巨噬细胞极化，抑制慢性炎症反应。他们后续通过分析人脐带间充质细胞释放外泌体携带mi-RNA表达谱发现，3种特异性高表达microRNA(miR-21、miR-146a和miR-181)与免疫调节密切相关［28］。Li等［29］也报道了人脐带间充质细胞释放的外泌体可通过转运miR-181c至巨噬细胞，从而抑制TLR4信号通路，减轻炎症反应。
（二）调节成纤维细胞增殖
成纤维细胞是真皮组织的主要细胞，由胚胎时期的间充质细胞分化而来［30］。成纤维细胞通过被创伤激活，继而增殖、迁移、分化及合成胶原蛋白和弹性纤维等细胞外基质成分来促进创面愈合。当创伤较严重或合并别的局部及全身疾病干扰时，成纤维细胞的相关功能出现紊乱，继而导致功能不足出现创面愈合不良或者增殖分化过度形成瘢痕［31］。
Shabbir等［32］发现，骨髓间充质干细胞分泌的外泌体可激活成纤维细胞的蛋白激酶B、细胞外调节蛋白激酶与信号传导及转录激活蛋白信号通路，提高其肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、神经生长因子与基质细胞衍生因子-1分泌能力，从而促进成纤维细胞的增殖与迁移能力。Zhang等［33］研究表明，人诱导性多能干细胞诱导来源间充质干细胞分泌外泌体可促进间充质细胞的增殖与迁移能力，促进其分泌Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白及弹性蛋白。Hu等［34］报道，脂肪间充质干细胞分泌外泌体可在体外培养环境下促进成纤维细胞的Ｎ-钙黏蛋白、细胞周期蛋白-1、增殖细胞核抗原和Ⅰ型、 Ⅲ型胶原蛋白基因表达；而在动物模型实验中，外泌体可显著加快小鼠背部创面的愈合速度；此外动物实验还表明，在愈合早期注射外泌体可提高创面Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白分泌从而促进伤口愈合，而在愈合晚期注射则可抑制上述2种胶原蛋白分泌，从而抑制瘢痕形成。Zhang等［35］通过体外实验及动物实验表明，脂肪间充质干细胞外泌体能够促进成纤维干细胞增殖、迁移、胶原蛋白及其他细胞生长因子合成分泌，继而促进皮肤创面愈合，而PI3K/Akt信号通路在这一过程中发挥关键作用。Choi等［36］研究同样表明，脂肪间充质干细胞外泌体主要通过miRNA来提高间充质细胞CD34、Ⅰ型胶原酶、 弹性蛋白及角质细胞生长因子等的表达，继而在皮肤创面愈合过程中发挥作用。
此外，滑膜间充质干细胞分泌外泌体［37］、循环纤维细胞分泌外泌体［38］及富血小板血浆［39］中分离获得的外泌体均可通过促进成纤维细胞相关功能，从而促进创面愈合。
（三）促进血管生成
皮肤创面局部的血管新生速度对于创面愈合来说至关重要，良好的新生血管可以增加创面血供，提供充分的营养支持，并带走代谢产物，减轻创面局部炎症反应，加强胶原蛋白生成，从而促进创面愈合［40］。
Kang等［41］报道，脂肪间充质干细胞分泌微泡可促进人脐静脉内皮细胞的迁移和血管形成能力；通过血管内皮细胞诱导培养基培养的脂肪间充质干细胞，其分泌微泡及对血管内皮细胞的促进作用明显优于普通培养基培养的干细胞；这一促进作用的机制是通过传递microRNA-31完成的，靶向基因为血管内皮细胞的抗血管生成基因HIF-1。Liang等［42］通过进行体外及动物实验表明，脂肪间充质干细胞分泌外泌体同样可通过传递microRNA-125a来抑制血管内皮细胞上的靶向基因抗血管生成基因DLL4，从而促进血管内皮尖端细胞的形成，继而发挥促血管化作用。Li等［43］研究报道，血管内皮祖细胞分泌获得外泌体可在体外实验中被血管内皮细胞摄取，并增加其血管化相关基因如白介素-8、促血管生成素-1、血管内皮生长因子受体-2、趋化因子配体、血管内皮生长因子A、内皮型一氧化氮合酶、E-选择素及成纤维细胞生长因子-1等的表达，从而促进血管内皮细胞的增殖、迁移及血管化能力；在动物实验中，该外泌体可促进糖尿病模型小鼠的创面愈合能力。Shabbir等［32］、Tao［38］等及Zhang等［33］研究表明，干细胞获得外泌体可促进成纤维细胞发挥相关促进创面愈合功能，同样可促进血管内皮细胞的血管化。
（四）抑制瘢痕形成
瘢痕是创伤愈合后产生的皮肤软组织的外观形态和组织病理学改变［44］，已有研究报道外泌体可通过多种机制抑制和预防创面愈合后瘢痕的形成。Wang 等［45］报道，脂肪间充质干细胞外泌体可通过降低Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白比例，提高基质金属蛋白酶-3与金属蛋白酶组织抑制因子1比例，提高转化生长因子-β3与TGF-β1比例，激活ERK/MAPK受体通路，抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，来抑制伤口瘢痕形成。Fang等［46］研究发现，脐带间充质干细胞可通过转运microRNA-21、-23a、125b及-145抑制TGF-β2/SMAD2信号通路，从而抑制肌成纤维细胞分化及瘢痕形成。Zhao等［47］的研究同样表明，高浓度人羊膜上皮细胞外泌体（100 μg/ml）可通过促进MMP1表达促进伤口愈合，抑制瘢痕形成。
三、 外泌体在整形外科其他方面的应用
目前外泌体除应用于创面的治疗以外，也有应用于整形外科其他方面治疗如皮瓣、脂肪移植、面部年轻化等的相关研究报道。
Pu 等［48］报道，脂肪间充质干细胞外泌体可转运IL-6并激活STAT3信号通路，从而提高皮瓣的存活能力，并促进皮瓣局部毛细血管形成。Bai 等［49］研究报道，脂肪间充质干细胞分泌的外泌体可通过抑制细胞凋亡、促进血管化及减少炎症细胞浸润来提高脂肪组织移植后存活率；通过缺氧环境培养脂肪干细胞获得的外泌体，其促进脂肪组织存活能力要优于一般培养环境下获得的外泌体。Kim等［50］报道，使用间充质干细胞外泌体处理人类皮肤组织，外泌体可在18 h后渗透进入表皮层，处理3 d后，皮肤组织中的Ⅰ型胶原蛋白与弹性蛋白表达增多，这显示了外泌体治疗应用于非手术面部年轻化的潜能。
四、小结与展望
外泌体可被多种干细胞合成和分泌，并调控受体组织细胞的相关功能。和直接利用干细胞进行治疗相比，外泌体的应用降低了细胞异常分化和成瘤的风险。目前，已有大量关于各种来源外泌体应用于皮肤创面愈合的研究见诸报道，表明外泌体应用于创面治疗具有巨大的临床应用前景。
然而外泌体治疗创面的相关研究仍面临很大的挑战，首当其冲的就是传统外泌体分离提取需要长时间的超速离心，并且需要大量的细胞或相关液体，尽管目前外泌体分离试剂盒已经成功商品化，得到了应用并且效率较高，但是由于获得的外泌体产物含有大量诸如脂蛋白等杂质，难以满足临床应用高纯度的要求［51］。其次，关于外泌体的其他方面的研究，如外泌体的分类、外泌体内含物的选择性转运、受体细胞摄取方式、不同干细胞分泌外泌体的类型及具体功能、除促进创面愈合是否还有抑制创面愈合的外泌体等，需要更多的研究探讨。再次，当前的研究以各种来源的间充质细胞分泌获得外泌体为主，而其余大量不同细胞及体液来源外泌体应用于创面治疗的相关研究较少。此外，外泌体具有稳定双侧磷脂膜结构，膜表面上有多种黏附蛋白，具有归巢能力，因此作为基因治疗递送载体具有明显的优势［52］，但是利用外泌体作为载体人工加载包括蛋白质、mRNA、microRNA等药物治疗创面仍有待于进一步研究。最后，目前相关外泌体治疗创面的报道仍以基础研究为主，而关于外泌体如何应用于临床治疗，包括给药途径、剂量、周期、相关并发症等也仍有待于进一步研究和探索。
