富含miR-873a-5p的星形细胞源性外泌体通过小胶质细胞表型调控抑

    创伤性脑损伤（TBI）一直是全球死亡和残疾的主要原因。由于TBI的复杂病理生理机制，有效的药物治疗仍然缺乏。许多研究已经确定，TBI后的神经炎症在继发性病理损伤中起着重要作用，其可能比原发性损伤具有更严重和深远的影响。

    小胶质细胞是引发炎症和免疫反应的居住在脑组织的免疫细胞。小胶质细胞被激活后迅速迁移到损伤部位，并在TBI后的神经炎症中发挥关键作用。最近的研究发现，小胶质细胞在TBI中的作用是一把双刃剑，取决于它们的两种极化状态：促炎（M1样）表型和抗炎（M2样）表型。调控小胶质细胞的极化，特别是促进TBI后M2表型的转化，可能是一种可能的治疗策略。虽然已经确定了一些分子作为选择性增加M2极化的因子，如IL-4、IL-10和TGF-β，但目前临床上仍缺乏有效的药物。

    星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的细胞类型，对维持微环境稳定和神经电路功能起着关键作用。以往的研究表明，星形胶质细胞和小胶质细胞在包括脑创伤在内的各种病理环境中都是活跃的参与者。活化的星形胶质细胞产生许多调控因子，影响中枢神经系统的免疫反应，并为活化的小胶质细胞提供负反馈。

    最近，外泌体（exosomes）被认为是细胞间通讯的信号传递体。通过携带蛋白质、RNA和miRNA，外泌体可以作为触发、转移和调节免疫反应的关键因素，在细胞之间起到重要作用。已有研究表明，中枢神经系统中的大多数细胞都会释放外泌体到细胞外环境中。虽然一些研究显示，星形胶质细胞释放的外泌体在多种病理条件下都是介导神经可塑性、免疫反应和神经存活的强力介质，但关于它们在小胶质细胞激活和脑创伤后介导神经炎症的功能，我们对其了解甚少。

    在本研究中，我们使用了体外TBI模型来研究星形胶质细胞释放的外泌体的组成及其对小胶质细胞激活的影响，这有助于我们进一步了解小胶质细胞与星形胶质细胞之间的相互作用。此外，还通过在小鼠TBI模型中研究潜在的功能性miRNA，来探索神经炎症相关损伤的新治疗靶点。

通过对“脑提取物”刺激星形胶质细胞合成和释放外泌体

    使用免疫荧光染色检测了原代培养的星形胶质细胞中外泌体的表达。通过Western blot分析星形胶质细胞在培养基中释放的外泌体。这两种检测方法都显示，在TBI“脑提取物”的刺激下，外泌体（由CD9和CD63标记）在24小时内显著增加（p < 0.05）（图1a-c）。然后，这些外泌体从星形胶质细胞中分离出来，并通过电子显微镜进行鉴定。透射电子显微镜成像显示，来源于星形胶质细胞的外泌体的直径主要在30-100nm范围内，并且检测到了标记蛋白CD9和CD63的存在。

Fig1.“脑提取物”刺激了星形胶质细胞合成和释放外泌体

a 来自星形胶质细胞的外泌体（由CD9（绿色）标记）在“脑提取物”的刺激下显著增加

b、c 在处理24小时后，收集原代培养的星形胶质细胞培养基，通过Western blot检测CD9和CD63标记物

d 显示经过处理24小时的刺激性星形胶质细胞培养基中纯化的外泌体的代表性透射电子显微镜图像。确定了星形胶质细胞来源的外泌体的标记物CD9和CD63

e 通过Western blot验证星型胶质细胞衍生的外泌体

星形胶质细胞释放的外泌体被原代培养的小胶质细胞摄取，并在TBI损伤后促进小胶质细胞形成M2表型

    为了确定星形胶质细胞释放的外泌体对小胶质细胞激活的影响，我们使用高速离心法分离外泌体，并将其加入原代培养的小胶质细胞中。我们使用PKH26染料（红色）标记外泌体，以评估外泌体是否被小胶质细胞摄取。如图2a所示，外泌体被小胶质细胞摄取。通过细胞免疫荧光、qRT-PCR和Western blotting检测小胶质细胞的蛋白质和基因表达。结果显示，来自星形胶质细胞的外泌体可以显著促进小胶质细胞向M2表型转化，并且在脑组织提取物的作用下获得的外泌体比正常来源的星形胶质细胞外泌体进一步促进了这种转化。

Fig2.星形胶质细胞释放的外泌体被原代小胶质细胞摄取，并促进小胶质细胞向M2表型转化

a 使用共聚焦显微镜观察PKH26染色和外泌体摄取。结果显示，外泌体（红色）被细胞摄取，并存在于细胞质和细胞核周围。原代小胶质细胞的免疫荧光显示DAPI（蓝色），外泌体（红色）和F-actin（绿色）。在PBS对照组中未检测到红色荧光信号。PBS：用PBS对小胶质细胞染色(对照)。

b、c 原代培养的小胶质细胞分为三组：con，con+Exo和Ext+Exo。Exo：小胶质细胞与星形胶质细胞释放的外泌体共培养4小时。Ext+Exo：原代培养的小胶质细胞在与外泌体共培养之前，通过“脑提取物”的刺激处理24小时并洗涤。通过Western blot分析检测这些M2标记物。

d、e 荧光共聚焦显微镜图像显示，在星形胶质细胞外泌体处理后，Iba-1（小胶质细胞标记物）和Arg-1（M2标记物）的表达均增加。在“脑提取物”的刺激后，这种效应更加显著。

f 通过RT-PCR检测小胶质细胞M2标记物（Arg-1、IL-4、IL-10）的mRNA表达

通过对被“脑提取物”刺激的星形胶质细胞释放的外泌体进行微小RNA（miRNA）芯片分析

    为了进一步探索星形胶质细胞释放的外泌体中的活性成分，我们进行了全基因组的miRNA芯片分析。结果显示，与对照组相比，被“脑提取物”刺激的星形胶质细胞释放的外泌体中有135种miRNA明显上调（变化超过2倍，p < 0.05）；其中最显著变化的20种miRNA包括miR-1224-5p、miR-708-5p、miR-383-5p、miR-873a-5p、miR-218-2-3p、miR-551b-3p、miR-873a-3p、miR-219a-2-3p、miR-128-1-5p、miR-128-3p、miR-124-5p、miR-544-5p、miR-124-3p、miR-7240-5p、miR-137-3p、miR-138-5p、miR-7055-3p、miR-137-5p、miR-382-3p和miR-3099-5p。我们的数据（miRNA芯片分析）显示miR-873a-5p是激活的星形胶质细胞释放的外泌体中所有miRNA变化中排名前5的miRNA之一。根据先前的研究和生物信息学网站（http://starbase.sysu.edu.cn）的数据库的进一步分析表明，miR-873a-5p可能对于NF-κB信号通路具有影响，该通路对于小胶质细胞的激活非常重要。基于上述的miRNA芯片分析，我们选择miR-873a-5p作为研究的重点。我们收集了临床创伤性脑损伤后3天的坏死和水肿区域的脑组织样本，并通过qRT-PCR检测了miR-873a-5p的表达。结果显示，损伤区域的miR-873a-5p表达显著高于水肿区域。

Fig3.对被“脑提取物”刺激的星形胶质细胞释放的外泌体进行miRNA芯片分析。

a CON：在生理条件下星形胶质细胞释放的外泌体。COR：在模拟创伤条件下星形胶质细胞释放的外泌体。通过miRNA芯片分析研究了被刺激的星形胶质细胞释放的外泌体中的miRNA成分。热图显示了前20个miRNA的变化。b miRNA分布图。横轴表示Ext组与CON组相比的多个miRNA，纵轴表示p值的Log10。

c 通过RT-PCR测量了创伤性脑损伤中坏死脑组织和水肿脑组织中miR-873a-5p的表达

miR-873a-5p对LPS诱导的原代小胶质细胞的影响

    为了进一步探索miR-873a-5p的功能，我们将miR-873a-5p转染至原代小胶质细胞，然后对其进行LPS刺激。我们使用Western blotting检测IL-1β、Hmgb1和INOS蛋白的表达。通过qRT-PCR检测TNF-α、IL-1β、INOS和IL-6的mRNA表达。结果显示，与LPS组相比，LPS+miR-873a-5p组中的促炎因子IL-1β、INOS、Hmgb1、TNF-α和IL-6的表达显著受到抑制，而LPS+NC组中这些促炎因子的表达没有受到抑制。

Fig4.miR-873a-5p对LPS激活的原代培养小胶质细胞的影响。

a–d LPS和miR-873a-5p处理的细胞中促炎因子Hmgb1、IL-1β和iNOS的Western blot和统计分析。

e–h 促炎因子TNF-α、iNOS、IL-1β和IL-6的mRNA水平的RT-qPCR分析

miR-873a-5p对培养的小胶质细胞中NF-κB激活的影响

NF-κB在炎症调控中扮演着关键角色。为了探索miR-873a-5p如何抑制炎症反应，我们使用Western blot技术检测了NF-κB信号通路。结果显示，脂多糖（LPS）显著激活了原代小胶质细胞中的NF-κB信号通路，包括Myd88、磷酸化的NF-κB和磷酸化的ERK。在介入miR-873a-5p后，Myd88、磷酸化的NF-κB和磷酸化的ERK明显受到抑制，而LPS + NC组中的NF-κB信号通路没有明显变化。这些结果表明，miR-873a-5p抑制了LPS激活的NF-κB信号通路。

Fig5.miR-873a-5p对原代培养小胶质细胞中NF-κB激活的影响。

a-d：Myd88、磷酸化的NF-κB和ERK的Western blot分析及统计学分析结果。

miR-873a-5p减轻了创伤性脑损伤小鼠的脑缺损区域、脑水肿含量和神经功能缺陷

    为了确定miR-873a-5p在创伤性脑损伤中的作用，我们使用CCI在小鼠中诱导了脑损伤，随后将miR-873a-5p注射到侧脑室。在脑损伤后的1、3和7天，通过qRT-PCR测量了大脑皮层中miR-873a-5p的表达。治疗miR-873a-5p显著增加了脑损伤后1、3和7天大脑皮层中miR-873a-5p的表达）。收集了受伤脑组织周围的组织以及模拟小鼠的类似区域。为了调查miR-873a-5p的神经恢复作用，我们在创伤性脑损伤后的第七天测量了损伤区域和脑水肿。我们还在伤后第7天确定了改良神经功能评分（mNSS）。结果显示，创伤性脑损伤后的脑损伤区域、脑水肿程度和神经功能评分都有所增加。然而，miR-873a-5p治疗显著减少了创伤性脑损伤后第7天的脑损伤区域和脑水肿程度。miR-873a-5p治疗后，mNSS也得到了改善。

Fig6. miR-873a-5p减轻了创伤性脑损伤小鼠的脑缺损区域、脑水肿含量和神经功能缺陷。

a miR-873a-5p治疗显著增加了创伤性脑损伤后1、3和7天大脑皮层中miR-873a-5p的表达。b 通过mNSS评估了小鼠的神经功能（数据以均值±标准差表示，与模拟组相比，*p < 0.05；与TBI组相比，#p < 0.05，n = 5，单因素方差分析）。c、d 通过比例法测定了小鼠脑缺损区域的大小。

e 通过干湿法测量了脑组织的水含量。

miR-873a-5p通过促进小胶质细胞M2极化抑制创伤性脑损伤后的炎症反应

    为了特异性评估创伤性脑损伤（TBI）后小胶质细胞的极化状态，我们使用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）来检测皮层中小胶质细胞的极化状态，通过检测M1标志基因INOS、CD32和IL-1β以及M2标志基因CD206、IL-4和Arginase 1的表达水平。结果显示，在TBI后的1、3和7天，皮层中M1标志基因CD32、INOS和IL-1β的表达以及M2标志基因CD206、IL-4和Arg1的表达显著上调。miR-873a-5p处理明显降低了TBI后皮层中CD32、INOS和IL-1β的表达）。此外，miR-873a-5p处理还显著增加了TBI后皮层中CD206、IL-4和Arg1的表达。此外，在受伤皮层的创伤灶中，典型的M1相关标记物（INOS）或M2相关标记物（Arg1）蛋白与小胶质细胞标记物Iba1进行了双标记。免疫荧光研究显示，INOS的表达在受伤皮层在受伤后第3天增加，并在第3天达到峰值，但通过上调miR-873a-5p而显著降低。miR-873a-5p的过表达增加了受伤皮层中M2标记物Arg1标记的细胞数量。这些结果与qRT-PCR的结果一致。综上所述，这些发现表明，上调miR-873a-5p表达显著改变了TBI后M1/M2表型平衡，通过抑制M1活化和增强M2活化。

Fig7.miR-873a-5p治疗通过促进小胶质细胞向M2极化促进了创伤性脑损伤后的炎症反应抑制。

a–c miR-873a-5p治疗显著降低了创伤性脑损伤后1、3和7天大脑皮层中CD32、INOS和IL-1β的mRNA表达。d–f miR-873a-5p增加了创伤性脑损伤后1、3和7天大脑皮层中M2小胶质细胞标志基因CD206、IL-4和Arg1的表达。

g，h 显示了在受伤大脑皮层中利用小胶质细胞标志物Iba1（绿色）和M1标志物iNOS（红色）进行的双重免疫荧光染色的代表性图像。

i，j 显示了在受伤大脑皮层中利用小胶质细胞标志物Iba1（绿色）和M2标志物Arg1（红色）进行的双重免疫荧光染色的代表性图像。

miR-873a-5p在小鼠TBI模型中对NF-κB激活的体内影响

    我们通过WB分析评估Myd88、ERK和NF-κB p65的表达，以研究miR-873a-5p在创伤性脑损伤后如何抑制NF-κB信号通路的细胞机制。我们在创伤性脑损伤后第7天收集了组织样本，因为在这个时间点，NF-κB信号通路被有效地抑制。在模拟小鼠的脑样本中，Myd88和磷酸化的ERK以及NF-κB p65的表达相对较低，而在创伤性脑损伤小鼠的脑组织中，Myd88和磷酸化的ERK以及NF-κB p65的水平显著增加。与创伤性脑损伤组相比，创伤性脑损伤+miR-873a-5p组中的Myd88和磷酸化的ERK以及NF-κB p65的表达显著降低。

Fig8.miR-873a-5p对小鼠创伤性脑损伤（TBI）模型中NF-κB活化的体内效应。

a–d 采集了在TBI后第七天的小鼠创伤性脑损伤模型的脑组织。Western blot显示，miR-873a-5p agonist的处理抑制了Myd88信号的激活，并逆转了TBI诱导的NF-κB和ERK的磷酸化。

    在这项研究中，我们确定了活化的星形胶质细胞可以通过释放经外泌体转运的miRNA来调节小鼠创伤性脑损伤模型中的小胶质细胞极化。虽然来自创伤性脑损伤激活的星形胶质细胞分泌的外泌体需要进一步探索，但我们的发现仍与以下证据一致：（1）创伤性脑损伤激活的星形胶质细胞衍生的外泌体富含miR-873a-5p，该miRNA可以促进创伤性脑损伤早期小胶质细胞的M2表型转化；（2）miR-873a-5p通过抑制ERK的磷酸化和NF-κB信号通路的激活，有效抑制了小胶质细胞释放的促炎因子，并促进了抗炎因子的释放；（3）miR-873a-5p的抗神经炎症作用能够减轻小鼠创伤性脑损伤模型中的mNSS和脑水肿。

    虽然小胶质细胞在创伤性脑损伤后的炎症和免疫反应中起着关键作用，但目前仍缺乏有效的治疗靶点来调节其激活和功能。最近的证据显示，小胶质细胞在许多病理生理条件下表现为双刃剑，其表型极化分为促炎性M1和抗炎性M2。这种M1/M2表型转化也可以观察到创伤性脑损伤后的神经炎症。我们以前的研究表明，促进小胶质细胞从M1转化为M2表型有益于减轻免疫反应并改善脑创伤后的神经功能障碍。然而，到目前为止，缺乏调节小胶质细胞表型的特定有效药物治疗。

    一些研究表明星形胶质细胞具有调节小胶质细胞活化的强大能力。许多研究表明，脑中的星形胶质细胞是传播和调节神经炎症的主要参与者。星形胶质细胞受到炎症介质和细胞因子的激活，产生许多可能影响中枢神经系统免疫的调节因子。有报道称，如TNFα和IL-1β等促炎细胞因子可能使星形胶质细胞向有害反应性状态（A1）转化。与此同时，与抗炎细胞因子IL-4的刺激可能导致更具保护性或修复性的反应状态（A2）。结果显示，创伤性脑损伤后A1表型标志物（iNOS和TNF-α）和A2表型标志物（TGF-β和Arg-1）均有增加。在我们之前的研究中，我们发现“脑组织提取物”中的IL-1β和IL-4得到了上调。这可能解释了为什么同时存在A1和A2星形胶质细胞表型。已有报道称，将星形胶质细胞培养基添加到小胶质细胞培养中可以通过为激活的小胶质细胞提供负反馈来增加抗氧化和抗炎基因的表达。

     然而，其潜在机制尚未明确定义。一些最近的研究提出外泌体参与了细胞间的相互通信。例如，Hu等人证明了暴露于吗啡的星形胶质细胞源性外泌体可以被小胶质细胞内体吞噬，从而导致Toll样受体7（TLR7）的激活。Sobue等人报道称，星形胶质细胞中MHC I的过表达影响了小胶质细胞的增殖以及神经元数量和树突密度，从而导致小鼠社会和认知缺陷，可能是通过星形胶质细胞产生的外泌体。然而，关于星形胶质细胞源性外泌体对小胶质细胞活化的免疫调节作用的报道很少。本研究的亮点是我们使用“脑组织提取物”刺激原代培养星形胶质细胞，模拟体内创伤性脑损伤。结果证实，刺激的星形胶质细胞产生和释放更多的外泌体，促进小胶质细胞从M1转化为M2表型。

    外泌体运载的物质非常复杂，包括蛋白质、miRNA和mRNA。我们关注的是miRNA，其潜在作用已逐渐受到重视。最近一些研究已经对星形胶质细胞源性miRNA进行了研究。Xu等人报道称，预处理星形胶质细胞中的miR-92b-3p可以通过外泌体转运到神经元，并减轻OGD诱导的细胞死亡和凋亡。星形胶质细胞中的miR-7可以导致神经元神经连结蛋白2（NLGN2）的下调，并最终导致HIV-1感染后的突触变化。通过高通量miRNA测序，我们发现在BE刺激后外泌体中miR-873a-5p的表达显著变化。这种miRNA通过抑制LPS诱导的小胶质细胞活化，表现出抗炎作用。这是首次报道了miR-873a-5p在调节创伤性脑损伤期间炎症中的功能。

    作为一个与肿瘤相关的miRNA，已经广泛认识到miR-873a-5p可以通过调节结直肠癌、子宫内膜癌和肝细胞癌等肿瘤中的某些分子来调控肿瘤的增殖和侵袭。崔等人报道称，乳腺肿瘤中miR-873a-5p的表达水平远低于正常组织。此外，miR-873a-5p的过表达或其模拟物在体外和体内小鼠模型中都可以抑制乳腺癌细胞的增殖。已经确定，miR-873a可以通过靶向SRCIN1增加肺腺癌细胞的增殖和迁移，并且在胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤组织和细胞系中其表达下调。刘等人首次报道称，由IL-17诱导的星形胶质细胞中miR-873促进实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中的炎症细胞因子产生并加剧去髓鞘化，通过A20/NF-κB信号通路。然而，miR-873的功能亚型及其与小胶质细胞的相关性仍不清楚。我们的结果表明，在创伤性脑损伤中，miR-873a-5p的表达增加，活化的星形胶质细胞通过释放miR-873a-5p可能是小胶质细胞介导的免疫反应的负反馈机制。这可能是调节神经炎症的潜在治疗靶点。这一现象在体外LPS刺激的小胶质细胞中也得到了证实。这些数据与刘等人的研究结果不一致。可能的原因是刘等人没有说明miR-873的哪个亚型在促炎过程中起作用。此外，miR-873a可能在星形胶质细胞中具有促炎作用，在小胶质细胞中具有抗炎作用，这也可能解释了中枢神经系统中的炎症平衡。这些数据共同展示了miR-873a-5p在调节小胶质细胞活化中的新作用。炎症反应是创伤性脑损伤后损伤的主要原因，miR-873可以通过抑制炎症发挥神经保护作用。

    NF-κB是一个经典的炎症信号通路，与神经毒性相关。本研究表明，NF-κB信号通路很可能是miR-873a-5p的重要靶点之一。miR-873a-5p通过抑制NF-κB信号通路可以将小胶质细胞的极化从M1转化为M2。miR-873a-5p的这种作用可以为未来的临床药物开发提供新的策略。