【临床研究】血清外泌体lncRNA对卵巢上皮性癌的诊断价值初步研究
目的 初步探讨血清外泌体长链非编码 RNA（lncRNA）对卵巢上皮性癌（卵巢癌）的诊断价值。
方法 （1）收集2018年8月至2019年12月在广西医科大学附属肿瘤医院住院治疗的卵巢肿瘤患者，包括卵巢癌35例（恶性组）和卵巢良性肿瘤20例（良性组）；收集同期在本院体检的健康妇女15例（正常组）作为对照。抽取3组妇女的外周静脉血，采用商品试剂盒分离、纯化血清外泌体；外泌体的鉴定：透射电子显微镜观察外泌体的形态，NanoSight纳米颗粒分析技术分析外泌体的粒径分布，蛋白印迹（western blot）法检测外泌体的特异性标志蛋白分化群（CD）63、CD81、肿瘤易感基因 101蛋白（TSG101）的表达情况。（2）随机抽取恶性组中4例卵巢癌患者（恶性测序组）和正常组中3例健康妇女（正常测序组），采用高通量测序技术分析两组妇女的血清外泌体差异表达的lncRNA，并筛选出差异表达明显的lncRNA；实时荧光定量PCR技术验证筛选出的差异表达lncRNA在恶性测序组和正常测序组妇女血清中的表达，进一步扩大样本量（即恶性组、良性组、正常组共70份血清）验证筛选出的差异表达lncRNA在其中的表达。（3）绘制筛选出的差异表达lncRNA诊断卵巢癌的受试者工作特征（ROC）曲线，评价其敏感度和特异度等诊断效能；构建多因子联合诊断模型，通过logistic回归模型结合ROC曲线，评价其对卵巢癌发生的诊断效能。
结果 （1）透射电子显微镜观察，血清外泌体为脂质双层膜结构，一侧呈凹陷的半球形或杯托样；NanoSight纳米颗粒分析技术分析显示，外泌体颗粒的直径峰值为127.6nm，直径30~150nm的外泌体颗粒占58.9%；western blot法检测显示，与卵巢癌细胞系SKOV3细胞相比，血清外泌体的特异性标志蛋白CD63、CD81、TSG101蛋白的表达强度明显增强。（2）高通量测序技术分析显示，相对于正常测序组妇女，恶性测序组患者血清外泌体中筛选出差异表达lncRNA425个（其中上调23 个、下调402个）；挑选上调、下调表达异常明显的 lncRNA 6个，即FER1L6-AS2、LINC00470、LINC01811、CXXC4-AS1、LINC02343、LINC02428，采用实时荧光定量PCR技术对恶性测序组和正常测序组妇女血清进行验证，其表达情况与测序结果一致。随后对这 6 个lncRNA进一步扩大样本量验证，恶性组患者血清外泌体中FER1L6-AS2、LINC00470、LINC01811的表达水平分别升高至良性组、正常组妇女的 1.66、1.84 倍，2.05、2.46 倍，2.94、2.35 倍，CXXC4-AS1、LINC02343、LINC02428 的表达水平分别下降至良性组、正常组妇女的 29%、34%，40%、46%，42%、42%，同一lncRNA的表达水平在恶性组与良性组、恶性组与正常组中分别比较，差异均有统计学意义（P均<0.05），而良性组与正常组分别比较，差异均无统计学意义（P均>0.05）。（3）6个差异表达lncRNA 单独诊断卵巢癌的 ROC 曲线下面积（AUC）为 0.722~0.805，具有中等诊断价值。联合因子预测模型 1（包括 FER1L6-AS2 和 LINC01811）、联合因子预测模型2（包括 CXXC4-AS1、LINC02343和LINC02428）、联合因子预测模型3（包括FER1L6-AS2、CXXC4-AS1、LINC02343和 LINC02428）的AUC分别为 0.865、0.934 和 0.962，各联合因子预测模型的诊断效能均显著高于单一 lncRNA 的诊断效能（P均<0.05）。
结论 经实时荧光定量 PCR 技术验证，高通量测序技术是筛选血清外泌体差异表达lncRNA 的有效方法；血清外泌体多个 lncRNA 联合检测对卵巢癌患者的诊断效能显著高于单一lncRNA检测。检测血清外泌体lncRNA可为卵巢癌的诊断提供新的思路。
一、血清肿瘤标志物诊断卵巢癌的现状和不足
肿瘤的发生是一个渐进式的、多因素、多级联、多基因突变参与的复杂过程。肿瘤标志物的检测可用于识别肿瘤的良、恶性，但单一肿瘤标志物难以达到理想的敏感度和特异度，故而使用单一肿瘤标志物对早期恶性肿瘤的诊断效能明显不足。多个肿瘤标志物联合检测，充分利用不同标志物在敏感度及特异度方面的有效补充，可提高早期恶性肿瘤的诊断效能；肿瘤标志物除了可以辅助诊断还可以用来监测肿瘤治疗的疗效及判断预后。目前，临床上最常用的卵巢癌标志物是 CA125和 HE4。约80% 晚期卵巢癌患者出现血清 CA125水平升高，然而，对于早期卵巢癌 CA125的诊断敏感度较差（Ⅰ期卵巢癌的诊断敏感度仅为50%），Ⅱ期及以上卵巢癌CA125的诊断敏感度升高至90%［10］。另外 ，CA125并非卵巢癌的特异性抗原，在非妇科肿瘤如乳腺、结肠和胰腺肿瘤中也会出现血清 CA125水平升高。此外，血清 CA125水平升高也常见于许多良性疾病（如子宫内膜异位症、子宫平滑肌瘤、盆腔炎、心力衰竭、肾脏疾病等）和约1%的健康妇女［11］。Zhen 等［12］通过荟萃分析显示，血清 CA125诊断卵巢癌的敏感度为 74%，特异度为83%，AUC为0.854，提示，CA125作为卵巢癌诊断的主要肿瘤标志物，尚有20%~30%的卵巢癌不能诊断，成为诊断的盲区，所以，仍需进一步寻找更为优良的卵巢癌（尤其是早期卵巢癌）的诊断标志物。目前，HE4 已经作为卵巢癌诊断的辅助指标应用于临床，被认为可能是除 CA125外最有价值的卵巢癌血清学标志物［13］。与CA125比较，HE4 具有更高的敏感度及特异度，诊断效能优于CA125［14］。然而，血清 HE4 水平也受到年龄、绝经状态、是否妊娠等多种因素的影响。有研究采用免疫组化法检测HE4在卵巢癌和卵巢交界性肿瘤组织中的基因表达，结果表明，在Ⅰ型和Ⅱ 型卵巢癌中 HE4 的表达有明显差异，提示，HE4可能成为区分交界性肿瘤和Ⅱ型卵巢癌的生物学标志物，但HE4识别Ⅰ型卵巢癌的作用有限［15］。有研究发现，HE4表达的高低对晚期卵巢癌治疗后短期内（前6个月）复发风险的评估有积极意义，但目前 HE4与肿瘤分期、淋巴结转移的关系及其参考值的确定尚存较大争议［16］。
二、血清外泌体 lncRNA 表达对卵巢癌的诊断价值
近年来，越来越多的研究表明，外泌体在肿瘤诊断、治疗、迁移生长、组织损伤修复及免疫抗原递呈等［17-19］方面都扮演着极其重要的角色。一方面，外泌体可以促进肿瘤转移，调控肿瘤进展，随着肿瘤的生长，外泌体被源源不断地释放进入肿瘤微环境；另一方面，外泌体作为多种功能性生物大分子的运载体，可携带 RNA（包括 lncRNA、miRNA 等）、蛋白质和脂质等，有研究表明其 RNA 和蛋白质可广泛参与对肿瘤侵袭和转移的调控［20］，它们或通过改变肿瘤微环境、促进血管生成和肿瘤转移，或直接作用于肿瘤细胞进而影响肿瘤进展。研究发现，恶性肿瘤患者的体液中外泌体含量及外泌体内容物（包括 RNA、蛋白质等）显著高于健康人群。
lncRNA 可以从基因间、基因内或特定的染色体区域被转录，与 miRNA 相比，lncRNA 有复杂的二级和三级结构（结构更稳定、组织特异性更强），其作用方式复杂多样，可在转录、转录后和表观遗传等水平调控基因表达进而广泛参与机体的生理、病理过程。目前，科研人员已进行了大量 lncRNA 在卵巢癌发病及进展中的机制研究，表明，部分lncRNA可通过相关的信号通路有效促进卵巢癌细胞增殖，强化卵巢癌细胞侵袭、迁移及上皮-间质转化功能，从而促进肿瘤生长［21-23］；而部分 lncRNA 通过相关信号通路可有效抑制肿瘤细胞的增殖、阻断细胞周期进程、促进肿瘤细胞凋亡，最终起到抑制肿瘤生长的作用［24］。以上研究提示，部分 lncRNA 有望成为卵巢癌诊治的潜在有效靶点。相对于从外周体液中直接提取的 lncRNA，从体液来源的外泌体中提取的lncRNA因有外泌体被膜保护具有表达量高及稳定性更好的优势。随着诊断技术的发展，外泌体成分检测方法不断创新，如外泌体分离微流控芯片、磁-电化学外泌体分析等技术为外泌体标志物的研究提供了高效、快捷的方法。外泌体标志物在卵巢癌的诊断方面，目前的相关报道仍集中于外泌体 miRNA［25-26］及蛋白质［27］的研究。目前，关于外泌体 lncRNA 标志物在卵巢癌中的研究报道少见。本研究中，采用高通量测序技术筛选出卵巢癌患者（与健康妇女比较）外泌体差异表达lncRNA 425个（包括上调23个、下调402个），挑选其中上调、下调明显的外泌体lncRNA（共6个 ，包括FER1L6-AS2、LINC00470、LINC01811、CXXC4-AS1、LINC02343、LINC02428）进行测序样本的实时荧光定量PCR技术验证，结果显示，实时荧光定量PCR技术检测结果与测序结果一致，说明，高通量测序技术结果可靠；对这6个目的 lncRNA 进行生物信息学分析发现，它们通过共同表达基因参与了蛋白质结合、肿瘤信号通路传导等过程；采用实时荧光定量PCR技术对扩大样本（恶性组、良性组、正常组妇女共70份血清样本）进行验证 ，结果显示 ，恶性组 FER1L6-AS2、LINC00470、LINC01811分别上升至良性组的 1.66、2.05、 2.94倍 ， CXXC4-AS1、 LINC02343、LINC02428 分别下降至良性组的 29%、40%、42%，两组分别比较，差异均有统计学意义（P均<0.05）；恶性组 FER1L6-AS2、LINC00470、LINC01811 分别上升至正常组的 1.84、2.46、2.35倍，CXXC4-AS1、LINC02343、LINC02428分别下降至正常组的34%、46%、42%，两组分别比较，差异也均有统计学意义（P均<0.05）。本研究通过分类树模型构建卵巢癌发生的预测模型，发现6个目的lncRNA均不同程度参与了识别卵巢癌的发生 ，FER1L6-AS2、LINC00470、LINC01811、CXXC4-AS1、LINC02343、LINC02428的AUC分别为0.749、0.722、0.789、0.805、0.764、0.739，提示，这6个外泌体 lncRNA 的诊断效能为中度（AUC<0.70提示诊断效能低，AUC为0.70~0.85提示诊断效能为中度，AUC>0.85提示诊断效能优）；使用logistic二元回归模型建立诊断卵巢癌的多指标联合预测模型，结果显示，联合因子预测模型 1、联合因子预测模型2、联合因子预测模型3的AUC分别为0.860、0.930、0.962，这些联合因子预测模型的诊断效能较单一外泌体 lncRNA显著提高，可以更有效地分辨卵巢肿瘤的良、恶性。LncRNA与肿瘤的发生、预防、诊断和治疗等密切相关，如：Yang等［28］研究肝癌组织中lncRNA的表达，结果发现，lncRNA-HEIH在肝癌组织中显著上调，使用短发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA）抑制lncRNA-HEIH的表达可显著抑制肝癌细胞的生长；Nie 等［29］研究发现，HOX 转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是结肠癌和肝细胞癌预后不良的可靠生物学标志物；另有研究表明，LINC00470在肝细胞癌细胞和组织中的表达上调，高水平LINC00470与肝细胞癌患者的肿瘤-淋巴结-转 移（tumor-lymph node-metastasis，TNM）分期晚和预后不良显著相关［30］。本研究中，卵巢癌患者血清外泌体 LINC00470 表达水平较卵巢良性肿瘤及正常人群高，其在分辨卵巢良、恶性肿瘤方面有一定临床价值（AUC为0.722）。在其他肿瘤中进行的相关研究提示，lncRNA GMDS-DT、ELMO1-AS1的异常表达与肿瘤患者的不良预后密切相关，这些指标有望成为新型生物学标志物用于肿瘤的诊断和预后评估［31-32］。
当然，本研究也存在一些不足，如：（1）用于测序分析的卵巢癌及健康妇女例数较少，可能会因为样本量的有限造成一些确有表达差异的lncRNA未被筛选出来或实际无表达差异的lncRNA被认定为有差异。（2）无论是芯片分析还是测序分析，均存在同一组别的样本间lncRNA表达的差异也很明显的情况，而在统计运算时目前的方法多是取均值（或中位数）代表某一lncRNA表达水平的高低，这势必会造成结果失真的情况发生。（3）由于收集标本困难及时间所限，本研究选取了少数 lncRNA 进行临床样本的实时荧光定量 PCR 技术验证并分析其诊断潜能，可能存在某些可能有更佳诊断潜力的lncRNA 未被发现；同时，因为样本量有限，这些诊断方面的相关数据较之真实世界的实际诊断效能尚有很大差距。故而本研究结果仅是初步探索（因为随着样本量的增减，每个 lncRNA分析出的AUC值、临界值、敏感度、特异度等均会随之改变）。（4）本研究对初步探索有差异表达的lncRNA，未能研究其与卵巢癌患者的相关临床病理指标（如手术病理分期、病理分级、淋巴结转移、血清 CA125 和HE4 等）及预后的关系，以上诸方面问题均需进一步深入研究。
总之，本研究发现，通过高通量测序技术分析、挑选血清外泌体差异表达 lncRNA 是高效的，其结果也是可靠的。扩大临床样本量进行实时荧光定量 PCR 技 术 验 证 的 结 果 表 明 ，部分差异表达lncRNA在卵巢癌患者血清外泌体中确实存在，初步研究提示，某些血清外泌体 lncRNA 可以区别卵巢良、恶性肿瘤患者及正常健康妇女，显示出有进一步探究其诊断卵巢癌的潜在价值。
