肿瘤来源外泌体的miRNA-1247-3p诱导癌相关成纤维细胞活化进而促

一、研究背景

肿瘤来源的因子和基质在转移龛中相互作用在促进肿瘤转移中具有重要作用。然而，肿瘤细胞如何控制转移位点形成的机制尚不完全清楚。在本研究中我们证实，在肺转移龛中，相比低转移性肝癌细胞，高转移性肝癌（HCC）细胞能将正常成纤维细胞转化成癌相关成纤维细胞（CAFs）的强大能力。我们发现高转移的HCC细胞分泌的外泌体来源的miR1247-3p直接靶向B4GalT3，导致成纤维细胞中β1-整合素-NF-κB信号的激活。激活的CAFs通过分泌促炎性细胞因子（包括IL-6和IL-8）进一步促进癌症进展。临床资料显示，血清外显子miR-1244-3P水平与肝癌患者肺转移密切相关。这些结果表明肿瘤细胞和成纤维细胞间的相互作用是由肿瘤来源的外泌体介导的，它控制着HCC的肺转移，这为预防和治疗癌症转移提供了潜在的靶点。

二、研究内容

1、说明了肿瘤来源的外泌体调控成纤维细胞活化并促进转移

a、b图说明本研究提取的肿瘤外泌体的鉴定。用电子显微镜和纳米微粒跟踪分析检测不同癌细胞释放的外泌体。c图为不同癌细胞外泌体中指示蛋白的免疫印迹分析。d图为共聚焦成像显示Dio标记的外来体（绿色荧光）向Dio标记的MRC5（红的荧光）的递送。黄色是两者重叠后的效果。e图为用来自不同肝癌细胞来源的外泌体或空白对照处理后的MRC5的迁移试验。f图为用qRT-PCR方法检测不同肝癌细胞或空白对照组分泌的外泌体对MRC5基因表达的影响。g图为MRC5压缩的胶原蛋白矩阵。经不同的肝癌细胞释放的外泌体或空白对照处理后的MRC5合同胶原蛋白的能力。f图为以荧光素酶为基础的生物发光成像法测定来自不同癌细胞的外泌体处理后小鼠的肺转移灶的代表性图像及定量分析。

2、主要介绍了外泌体中MiR-1247-3p调控成纤维细胞活化

a图说明在热图中显示了来自不同癌细胞中miRNA的微阵列分析。b图用四环图挑选两组中均表达上调的miRNAs。c图用模拟表达物转染MRC5的促炎基因表达的qRT-PCR分析。d图为MRC5转染miR－1247后及正常对照组的迁移分析。e图为将MRC5处理 CQT-2或HCC-LM3来源的外泌体的迁移能力比较，其中外泌体经过miR-1244-3P抑制剂的处理。f图为qRT-PCR法检测miR-1244-3P抑制剂处理及不处理，HepG2与CQT-2或MHCC-97来源的外泌体的MRC5相关基因的表达。

3、主要介绍了成纤维细胞中外泌体的miR-1247-3p直接靶基因为B4GALT3

a图为应用两种生物信息学工具预测miR-1247-3P的靶基因。b图为MRC5转染miR-1247-3p或正常对照中B4GALT3表达的qRT-PCR和免疫印迹检测。c图用模拟表达物转染MRC5的促炎基因表达的qRT-PCR分析。d图为miR1247-3p和B4GALT3之间的野生型和突变型结合位点。e、f图为MRC5的相对荧光素酶活性。h图为MRC5促炎基因表达的qRT-PCR分析。

4、介绍了外泌体的miR-1247-3P通过激活B4GALT3-β1-integrin-NF-κB信号通路进而活化成纤维细胞

a、 b图为条件培养基刺激过的MRC5及来自不同肿瘤细胞的外泌体中指示蛋白的免疫印迹试验。c、d图为在不同肿瘤细胞的外泌体及条件培养基刺激过的MRC5中NF-κB的相对荧光素酶活性。e为MRC5中指示蛋白的免疫印迹试验。f图为miR-1247-3p对MRC5蛋白表达的影响在有无β1整合素表达的抑制的情况下。h图为MRC5有无转染B4GALT3后β1-整合素的降解分析。

5、介绍了由miR-1247-3p激活的成纤维细胞可以促进肝癌发展。

a图为用ELISA法检测表达miR-1247-3p的MRC5中IL-6和IL-8的表达。b图为干性相关基因SMMC-7721表达的qRT-PCR分析。c图为条件培养基处理后SMMC-7721成球实验。d图为条件培养基处理后SMMC-7721加入抗IL-6／抗IL-8抗体或IgG对照抗体后的成球实验。e图为SMMC-7721 中EMT相关基因表达的qRT-PCR分析。f图为条件培养基刺激SMC—7721后的迁移试验。g图为加入抗IL-6／抗IL-8抗体或IgG对照抗体后，经条件培养基刺激后SMMC-7721的迁移能力。h图为含有抗IL-6／抗IL-8抗体或IgG对照抗体的条件培养基刺激后SMMC-7721的索拉非尼细胞毒性测试。 i图为用含有抗IL-6 /抗IL-8抗体或IgG对照抗体的条件培养基刺激后的SMMC-7721对索拉非尼的相对细胞活力测试。j图为Western blot法检测SMMC-7721标记蛋白。k图为将转染后的SMMC-7721进行裸鼠的异种移植试验。左图代表肿瘤大小，右图为相应的肿瘤生长曲线。i图为ELISA法检测原代正常成纤维细胞及原代肿瘤相关成纤维细胞中IL-6和IL-8分泌情况。用qRT-PCR方法检测原代正常成纤维细胞及原代肿瘤相关成纤维细胞中B4GALT3的表达水平。

6、介绍了肝癌中miR-1247-3p与肺转移密切相关。

a、 b图说明用电镜和纳米颗粒追踪分析法检测正常肝组织和肝癌血清中的外泌体。c图说明健康人群和原发性肝癌患者血清外泌体中miR-1244-3p的表达水平。d图为原位杂交检测HCC标本中miR-1247-3p水平。e图为K- M图对85例原发性肝癌患者的总生存率和无病生存率进行了分析，并对miR-1247-3P的表达进行分层，用K-M法和对数秩检验法分析生存数据。f图为miR-1247-3P与HCC标记物（AFP）和成纤维细胞标志物（α-SMA）联合检测HCC组织和肺转移组织标本。红色箭头表示成纤维细胞；黑色箭头表示肿瘤细胞。g图为肿瘤外泌体miR-1247-3p介导成纤维细胞活化促进肝癌肺转移的机制示意图。

总结：

肿瘤转移微环境中的肿瘤的分泌物与基质之间的交流对促进癌症转移具有关键作用。然而，该机制还不是很清楚。本研究是来自第二军医大学东方肝胆外科研究所的王红阳院士和杨文副研究员课题组在Nature Conmmunications杂志发表论文，通过microarray检测高转移癌细胞和低转移癌细胞的外泌体，发现肿瘤来源的关键外泌体miRNA能在转移前微环境中将成纤维细胞转化成CAF。此外，CAF通过增加促炎性细胞因子的分泌来促进肿瘤细胞的一系列特性。研究发现，原发肿瘤细胞与基质细胞之间的双向相互作用是一种新的转移发生机制。