可溶性因子和细胞外囊泡：临床MSC 分泌组疗法转化之路

间充质基质细胞分泌组：一种新兴的生物治疗药物

过去十年间，间充质基质细胞不仅作为治疗性细胞本身，更作为强效生物活性信号的来源，引起了越来越多的关注。MSC 是组织常驻的多能细胞，具有公认的免疫调节和促修复功能，这些功能主要通过其分泌的多种分子来实现。这些分泌产物的集合——称为 MSC 分泌组——包括可溶性因子和细胞外囊泡，它们运输蛋白质、脂质和核酸。这些产物共同调节炎症、血管生成和组织再生，最终形成了一个可设计的、即用型无细胞生物治疗平台，具有广泛的临床潜力。这些成分共同协调再生和免疫调节反应，包括血管生成和组织修复。虽然最初认为 MSC 通过植入发挥作用，但临床研究表明，大多数输注的细胞会被迅速清除，这支持了向旁分泌机制的范式转变。因此，分泌组作为 MSC 治疗活性的主要介导者而受到重视。

基于分泌组的产品绕过了活细胞疗法的关键局限性，包括低滞留率、供体变异性和血栓形成或不受控制的增殖等安全风险。作为无细胞制剂，它们在符合药品生产质量管理规范的生产方面具有优势，包括给药前成分明确、精确剂量、长期储存和即用型制剂。

然而，MSC 分泌组仍远未成为一种成熟的产品类别。其组成具有高度可塑性，随细胞来源、培养条件和环境信号而变化，这使得重现性和监管批准复杂化。缺乏统一的质量标准进一步限制了不同生产工艺之间的可比性，并减缓了临床转化。

最近的几篇综述集中于生物学机制或疾病特异性应用，但生物加工、制剂和监管转化的关键方面仍未得到充分探索。

在这项研究中，我们采用转化性、以产品为中心的视角，遵循"工艺决定产品"的原则。我们提出了一个涵盖上游生物加工、下游加工、制剂、递送工程和监管考虑的路线图。通过将 MSC 分泌组定位为一种新兴的生物治疗药物，本综述架起了生物学前景与工业化准备之间的桥梁，并为加速临床转化提供了指导。

亮点

• MSC 分泌组汇集了可溶性分子和细胞外囊泡，形成了一类有前景的新型无细胞治疗药物。

• 制造进展受到供体间变异性、批次不一致以及需要更强质量控制标准的限制。

• 由于缺乏经过验证的效力测试，并且对分泌组分在体内的行为了解有限，临床转化受到减缓。

• 多组学分析、智能递送系统和人工智能的进展正在推动下一代分泌组技术的发展。

• 广泛的国际标准以及科学家、工程师、临床医生和监管机构之间的紧密合作对于安全有效的转化至关重要。

   

可扩展的 MSC 分泌组生物制造

MSC 来源和细胞库

MSC 组织来源的选择是分泌组组成和效力的关键决定因素，骨髓、脐带、脂肪组织、牙髓和诱导多能干细胞来源的 MSC 之间存在显著差异。这些差异影响免疫调节活性、血管生成以及 EV 产量和稳定性，强化了"工艺决定产品"的转化原则。

BM-MSC 是历史基准，但需要侵入性采集，且特别受供体依赖性异质性的影响。UC-MSC 比其他原代来源扩增更快，免疫原性低，并且能很好地适应封闭的、符合 GMP 的平台。AT- 和 DP-MSC 丰富且易于获取，但产量不稳定，且在不同司法管辖区面临不一致的监管接受度。iMSC 提供理论上的可扩展性和可重复性，但其使用引发了关于基因组稳定性和致瘤潜力的担忧，迄今为止促使了更严格的监管评估和更高的开发成本。永生化 MSC 可以提供一致的输出，但面临重大的安全和监管障碍。

无论来源如何，具有明确身份、无菌性和遗传稳定性标准的标准化细胞库对于减少变异性至关重要。早期来源选择应与预期的产品概况和预先指定的关键工艺参数和关键质量属性相关联，从而影响预处理、生物反应器扩增和 GMP 开发。

在此基础上，MSC 来源确定了分泌组的基线特征，包括可溶性因子和 EV 相关组成、增殖行为、扩增过程中的供体间变异性，以及对缺氧或炎症细胞因子等预处理信号的响应性。这些固有属性限定了可行且可重复的预处理窗口。围产期来源（如 UC-MSC）可以非侵入性方式获得，并且因其增殖特性和符合 GMP 导向生产的免疫表型，已被广泛探索用于同种异体应用。成体来源，特别是 BM 和 AT 来源的 MSC，仍然是表征最广泛的，并继续主导针对多种适应症的转化和临床开发项目。综合来看，这些来源依赖性属性塑造了早期的 CPP，并为选择可扩展的上游扩增策略以及下游浓缩和纯化方案提供了信息，这些方案是在 GMP 下实现以效力为导向的 CQA 所必需的。

增强效力的预处理策略

MSC 分泌组具有高度可塑性，并受环境信号动态塑造，这为通过受控预处理增强效力创造了机会。缺氧被广泛用于通过稳定 HIF-1α 和增加 VEGF 以及 EV 携带的 miR-210 来增强再生和血管生成功能。然而，长时间或不受控制的缺氧暴露也可能触发促肿瘤信号，这突出了定义工艺窗口的必要性。

使用 IFN-γ 和 TNF-α 进行炎症驯化，使分泌组富含 IDO、PGE2、TSG-6 和调节性 miRNA，从而促进免疫调节表型。同样，增加 TGF-β 或 IL-1β 可增强抗炎输出，但缺乏标准化的剂量和时间限制了可重复性。

物理化学信号和机械信号调节可溶性因子和 EV 相关组分的组成、相对平衡以及整体分泌组产量。虽然这些方法很有前景，但由于供体和培养的变异性，它们仍然难以标准化。

新兴策略将预处理整合到封闭、自动化的生物反应器中，在其中氧张力、细胞因子递送和机械输入作为 CPP 被实时监测。将这些 CPP 与效力相关的 CQA 联系起来，可以实现可扩展的、符合 GMP 要求的上游控制。

上游加工和生物反应器设计

静态 2D 培养在研究中使用广泛，但劳动强度大、开放易污染，且不足以满足临床剂量需求。因此，符合 GMP 要求的生物反应器至关重要，它们提供封闭操作、自动化和降低的污染风险。

搅拌槽反应器能够在微载体上实现高密度 MSC 扩增，但需要仔细优化剪切力，这增加了工艺复杂性和成本。中空纤维系统提供准 3D 环境，具有有效的质量转移和持续的产品输出，尽管长期运行面临堵塞和清洁要求的挑战。垂直轮和摇动生物反应器提供温和混合和均匀的培养条件，并已显示出改进的可扩展性和可重复性。灌注和支架集成平台显示出连续生产的潜力，但仍处于早期阶段。

实时监测氧气、pH、葡萄糖和乳酸可实现 CPP-CQA 映射。数字控制提高了站点间可比性，尽管生产力的提高可能改变 EV 和可溶性因子的组成。协调统一的监管指南和具有成本效益的封闭系统对于可扩展的 GMP 应用至关重要。

因此，生物反应器作为小规模研究和临床相关制造之间的技术桥梁——前提是上游的收益能与下游加工相匹配，以保持生物活性和纯度。

在此背景下，反应器模式直接塑造上游收获物的组成和杂质谱，包括囊泡和非囊泡颗粒分布、可溶性蛋白背景和宿主细胞污染物，从而制约了下游加工。对于以 EV 为中心的制备，升高的可溶性蛋白携带量通常需要结合 TFF 和 SEC 的混合方法，以平衡回收率和纯度，而在全分泌组流程中，过度的蛋白质耗竭可能会损害生物活性。这些上下游耦合必须通过 CPP-CQA 映射和可比性计划来证明其合理性。

下游加工和纯化

收获的分泌组含有 EV、可溶性因子以及残留细胞、胞质损伤相关分子模式、蛋白质和核酸等污染物。DSP 将此混合物转化为可重现的、符合 GMP 要求的临床用产品。

超速离心虽然在研究中常见，但由于可扩展性差和囊泡损伤，不适合 GMP。可扩展的方法——切向流过滤或透析过滤——能够在封闭条件下进行浓缩和缓冲液交换，而无菌过滤确保了安全性和批次可比性。尺寸排阻色谱法提供高纯度，是研究的黄金标准，但有稀释和回收率有限的问题，而色谱方法可以富集特定的 EV 亚群或蛋白质组分，但对于 GMP 而言仍然成本高昂且技术复杂。混合工作流程（例如 TFF + SEC）平衡了通量、回收率和纯度，越来越多地被探索用于转化。相比之下，基于聚合物的沉淀快速且廉价，但会引入污染物并导致批次间不一致，使其不适合临床开发。

为了说明混合 DSP 的原理，最近在以 EV 为重点的工作流程中的实施表明，TFF + SEC 利用了互补优势。TFF 预浓缩大体积并在封闭、可自动化的条件下去除低分子量污染物，而 SEC 随后以高组成保真度将 EV 与共分离的可溶性蛋白分开。比较研究报告称，与单步超速离心或单独使用 SEC 相比，TFF + SEC 具有更高的颗粒与蛋白质比率、保留的 EV 形态和改进的回收率，且格式与 GMP 规模放大兼容。然而，在全分泌组制备中，可溶性蛋白构成生物活性产品的基本部分，通常不希望进行广泛的基于 SEC 的蛋白质耗竭；在这些情况下，TFF 被优先用于去除小分子杂质，同时保留更广泛的分泌因子谱。关键的是，TFF 膜 MWCO、跨膜压、剪切暴露和透析过滤体积，以及 SEC 树脂孔径、床高和流速，作为 CPP 作用于 CQA，如纯度、特性和效力。

DSP 还必须保持 EV 和可溶性因子的生物活性，它们对灭菌步骤和长期储存高度敏感。由于 DSP 直接决定最终产品质量和监管可接受性，它构成了上游制造策略与下游质量控制框架之间的关键桥梁。

质量控制和数据分析

稳健的 QC 框架对于确保 MSC 分泌组产品的一致性、安全性和有效性至关重要。QC 要求因全分泌组与 EV 富集组分而异，因为对纯度、稳定性和生物活性的相对重视程度不同。在各种形式中，关键的 CQA 包括特性、纯度、安全性和效力，它们共同支撑监管接受度。

特性和纯度评估必须区分 EV 和可溶性组分。EV 通常通过 NTA、DLS 和电子显微镜进行表征，这些方法提供尺寸、浓度和形态信息，但对组成异质性和胞质污染物缺乏敏感性。可溶性组分使用靶向蛋白质或细胞因子测定法进行分析，当需要更广泛的分子谱分析时，则通过基于 LC-MS 的蛋白质组学工作流程进行分析。尽管蛋白质组学提供了深入的表征，但它是资源密集型的，并且不能直接预测效力。对于这两个组分来说，一个主要挑战是检测作为 DAMPs 的胞质杂质，这些杂质构成显著的安全风险。基于组学的方法可以帮助识别替代效力标记，但对于批次放行而言仍然成本高昂、技术复杂且标准化不足。

无菌、支原体和内毒素的安全性检测仍然是强制性的。全分泌组制剂还需要检测残留 DNA、蛋白质和 DAMP，反映了其更大的组成复杂性。

效力仍然是最具挑战性的属性。功能性测定，如 T 细胞抑制、巨噬细胞极化和血管生成模型，被认为是黄金标准，但劳动强度大、标准化程度低，且不适合快速放行。EV 或可溶性组分内的替代效力标记正在被积极研究，作为可扩展的放行检测方法。

从转化的角度来看，监管机构越来越强调将 CPP 与 CQA 联系起来，确保上游和下游的选择影响效力。在统一的效力测定、参考材料和国际可比性框架方面的进展，将对监管准备至关重要。

总之，这些分析层面创建了一个流程，其中来源选择、预处理、上游培养、纯化、制剂和 QC 必须标准化，以符合合规性和临床成功。因此，QC 作为分析支柱，将制造决策与临床适用性联系起来，为制剂和递送铺平道路。

工程化递送系统

用于稳定性的制剂

MSC 分泌组的治疗潜力不仅取决于其组成，还取决于其在储存和给药期间的稳定性。作为蛋白质、脂质和囊泡的混合物，它容易发生聚集、蛋白水解和生物活性丧失。冷冻保存和冻干越来越多地应用于保持功能，而稳定赋形剂和递送载体正在测试中，以改善长期可重复性。然而，没有通用的解决方案。旨在稳定产品的干预措施可能会无意中改变货物组成或生物活性。因此，在不损害效力的情况下保持稳定性仍然是一个核心的转化挑战。

递送平台：控释和靶向

MSC 分泌组治疗药物的递送平台最好通过联合考虑控释机制、靶向策略和代表性的临床前疗效来解释。控释行为决定了靶向可以发挥作用的药代动力学窗口；反之，靶向要求反馈到载体设计中，以平衡全身暴露和组织富集。生物材料的物理化学和机械特性关键地影响释放动力学、分泌组分的结构和功能稳定性以及局部生物活性。

水凝胶可作为可注射的储库，通过网络化学、刚度、降解动力学和基质相互作用来保持生物活性并调节释放。它们可以用亲和基序进行功能化，将分泌组分集中在损伤部位，提供无需全身循环的局部基质靶向。这适用于暴露必须保持局部和持续的适应症，并已在临床前研究中改善了组织修复。由于分布受到空间限制，通常不需要系统性的配体修饰。

对于需要全身递送和组织渗透的适应症，纳米颗粒能够实现控释，同时支持主动靶向。PEG 化减少调理作用并延长循环，从而为配体介导的靶向创造窗口，以增强血管或组织结合。PEG 化与配体修饰协同作用，克服 MPS 清除并改善向炎症或难以触及的组织的递送。PLGA 的监管熟悉度进一步促进了转化，其生物相容性和释放行为主要由制剂参数而非聚合物本身驱动。

可植入支架提供机械支撑和持续的局部释放，将囊泡和可溶性因子保留在稳定的结构中。它们的优势在骨科适应症中最为明显，其中固定储库在明确的愈合窗口内维持旁分泌梯度；在这些局部应用中，全身靶向几乎没有额外价值。

机制驱动的适用性如下：对于局灶性、可通过手术或注射途径到达的病变，水凝胶和支架优先考虑局部暴露和控释；对于弥漫性或深部疾病，纳米颗粒利用 PEG 化实现的循环来支持配体靶向和组织富集。在各种平台中，需要早期与 GMP 对齐，以便递送特异性的 CPP 映射到 CQA，并支持可比性。

临床转化和监管路径

MSC 来源分泌组产品的临床转化提出了独特的监管挑战。这些无细胞产品缺乏活细胞，但仍表现出复杂的、多因素的的作用机制，使其难以在传统框架内进行分类。尽管迄今为止尚无 MSC 分泌组产品获得全面上市许可，但欧洲、美国和日本的监管机构已开始建立为开发策略提供信息的监管路径和先例。

在欧盟，分类取决于产品的组成和作用机制。仅由天然、非基因修饰的可溶性因子和囊泡组成的分泌组产品通常被视为 Directive 2001/83/EC 下的生物医药产品。除非它们涉及重组核酸或工程化载体，在体内赋予基因修饰效果，否则它们通常不符合 Regulation (EC) No. 1394/2007 下的 ATMP 资格。尽管如此，边缘案例由 EMA 的 CAT 通过正式的分类程序进行评估。监管档案必须证明符合 GMP 要求、广泛的产品表征以及原材料和供体的可追溯性。临床试验申请在国家层面处理，EMA 提供关于产品特定质量和安全性要求的科学建议。

在美国，用于治疗目的的基于分泌组的产品作为生物制品受到监管。这些产品不符合 '361 HCT/P' 途径的豁免条件，因为它们未能满足最小操作和同源使用的标准。为了支持 IND，申办方应提交详细的 CMC 数据、非临床安全性研究以及符合 GCP 的强健临床试验方案。尽管迄今为止基于外泌体的产品受到最严格的审查，但相同的原则广泛适用于基于分泌组的治疗药物。截至 2024 年，尚无分泌组产品获得 FDA 批准，但多个早期项目正在审查中。细胞基 MSC 产品 remestemcel-L 的批准为可能与分泌组项目相关的质量和效力要求提供了监管见解。

在日本，MSC 分泌组产品作为生物医药产品受到 PMDA 监管。与可能有资格根据《再生医学安全法》获得有条件早期批准的细胞基再生疗法不同，无细胞产品必须遵循传统的批准途径，包括完成所有三个临床阶段。监管期望包括完全符合 GMP、全面的产品表征以及一致性、安全性和生物活性的证明。PMDA 已表现出对新兴无细胞生物制剂领域的主动参与：2023 年，其科学委员会发布了关于 EV 基产品制备和临床评估的技术考虑，其中许多更广泛地适用于基于分泌组的治疗药物。

在所有三个地区，共同的监管期望正在形成。当局要求对分泌组产品进行强健的定义，包括组成一致性以及将生物活性含量与治疗意图联系起来的明确理由。制造过程必须标准化且可重复，并控制解决 MSC 来源分泌组固有异质性的问题。考虑到所涉及的多效性和多因素机制，效力测定是一个特别的挑战。此外，长期储存稳定性、无菌保证和细胞来源的可追溯性被认为是任何临床开发计划的基本要素。

尽管在分类和术语上存在地区差异，但监管机构正在就共同的科学关切达成一致：如何表征复杂的无细胞混合物，如何确保一致的生物活性，以及如何在缺乏单一活性物质的情况下定义质量属性。因此，基于 MSC 分泌组产品的开发者必须尽早与监管机构接触，适时寻求正式的科学建议，并从一开始就采用将制造、临床前和临床规划相结合的质量源于设计的方法。

挑战与未来方向

产品异质性和变异性

MSC 分泌组的异质性仍然是临床转化的主要障碍。其组成受供体特征、MSC 组织来源和培养条件的影响。这种可塑性导致批次间变异性，损害可重复性并减缓监管批准。

例如，EV 货物和可溶性因子水平在不同供体批次之间可能有很大差异，导致效力不一致。缓解措施需要标准化的细胞库以及统一的来源/预处理协议。创新策略也在涌现，例如使用巨噬细胞"教育"MSC 以获得更一致免疫调节特性的共培养方法，目前正在临床评估中。封闭、自动化的生物反应器与数字监控有助于减少操作员依赖性并建立稳定的 CPP-CQA 联系。

克服异质性既需要技术进步，也需要国际共识关于制造标准。关键的争论包括永生化 MSC 系——提供可扩展、稳定的生产——是否能与安全问题相协调，或者原代细胞是否应因其变异性而仍然受到青睐。解决这些争议对于监管接受度和可比性至关重要。

效力测定和机制见解

定义效力可以说是分泌组开发中最紧迫的未满足需求。当前的放行标准依赖于功能测定，但这些耗时、依赖操作员、标准化程度低，并且对临床疗效的预测价值有限。

一个主要瓶颈是体外效力与患者结果之间的弱相关性，这使得剂量定义和监管批准复杂化。基于组学的分析开始识别适用于可扩展放行测试的替代效力标记，但在验证和跨平台可比性方面仍存在挑战。

对分泌组作用模式的更深入机制见解对于弥合这一差距至关重要。将功能指标与分子特征相结合的多因素效力测定可以为监管机构提供强健、可重复的工具，同时加速批次放行。

药代动力学和生物分布

对 MSC 分泌组体内命运的理解仍然不明确。全身给药后，大多数 EV 和可溶性因子被快速隔离在清除器官中，限制了在目标组织的可用性。

由于缺乏标准化的分析工具以及动物模型通常无法捕捉人体生理学的局限性，进展受到限制。新兴策略正在产生定量见解，但预测性 PK 框架仍然不发达。

没有强健的 PK 数据，定义剂量、频率和给药途径就变得困难——这些参数对于开发和监管批准都至关重要。未来的工作应整合实验和计算方法，以设计合理的给药方案，并用药理学上有意义的数据加强监管提交。

下一代产品的技术创新

MSC 分泌组治疗药物的未来将由技术融合驱动。AI 和 ML 可以优化培养条件，预测产品质量，并将多组学数据集整合到可行的效力标准中。

智能释放平台提供递送的时空控制，可能减少给药频率并提高疗效。合成生物技术提供了一条颠覆性路径：工程化设计型 MSC 或无细胞系统，能够分泌定制的因子组合，具有确定的效力和减少的变异性。

最后，模块化生物加工和制造工作流程的数字孪生可能实现实时反馈控制，并将该领域从经验优化转向数据驱动的生物制剂设计。总之，这些创新解决了当前的局限性，并可能将基于分泌组的疗法重新定义为可编程、可设计的生物治疗药物。

结论

MSC 分泌组的治疗潜力已毋庸置疑；尚不确定的是如何将其转化为标准化、可扩展且获得临床批准的生物治疗药物。迄今为止，大多数进展已在临床前阶段实现，有强有力的证据表明其在多种疾病模型中的免疫调节和再生益处。然而，临床转化需要将分泌组重新定义为一个具有明确质量属性的制造产品，并通过对供体选择、培养条件和 DSP 的强健控制来确保一致性。

一个关键的瓶颈是缺乏与临床结果相关的效力测定和作用机制标记物。组学分析、高通量生物测定和机器学习方面的进展为捕捉分泌组复杂性同时生成实用的放行标准提供了机会。没有这些工具，监管机构就无法建立标准化的评估框架，从而延迟患者获得具有变革潜力的疗法。

制剂和递送也是一个关键的前沿领域。创新的生物材料、水凝胶和纳米颗粒系统旨在克服快速清除，并实现分泌组分的靶向、持续释放。这些方法可能将生物学功效与药学可行性联系起来，支持可预测的 PK 和改善的治疗指数。

展望未来，技术融合将重塑该领域。AI 将加速工艺优化和质量预测；合成生物技术将支持具有定制组成的下一代分泌组；数字化生物制造将实现实时 GMP 控制。总之，这些进展可能将当前的局限性转化为可编程、可设计的生物制剂的机会。

核心信息很明确：工艺决定产品。细胞生物学家、工程师、临床医生和监管机构之间的多学科合作对于 MSC 分泌组从实验概念发展为可重复、可扩展、国际标准化的疗法至关重要。如果成功，MSC 分泌组产品可能会开创一类新的即用型生物治疗药物，重塑再生医学和免疫调节。

待解决的关键问题

• 如何协调供体变异性、组织来源和培养条件，以减少分泌组组成的批次间变异性？

• 哪些标准化的效力测定能够可靠地捕捉复杂分泌组产品的生物活性并预测临床结果？

• 哪些分子或功能生物标志物可以作为全球监管机构接受的通用放行标准？

• 如何开发预测性药代动力学和生物分布模型，以合理指导剂量、频率和递送途径？

• 哪些制剂和递送系统最有希望克服快速清除，并实现持续、靶向的治疗活性？

• AI、合成生物技术和数字化生物制造平台能在多大程度上重新定义分泌组生产的设计、监控和控制？

• 国际监管框架如何趋同，以建立质量控制、安全性和有效性的共同标准？

• 学术界、工业界和监管机构之间的哪些合作模式将加速从实验研究到符合 GMP 的临床产品的转化？

来源：Rossello-Gelabert M, Escacena N, Igartua M, Santos-Vizcaino E, Hernandez RM. Translational pathways for MSC secretome therapies: from bioprocessing to delivery. Trends Biotechnol. 2026 Jan 9:S0167-7799(25)00501-3. doi: 10.1016/j.tibtech.2025.12.003.